5-hidroximetil-citosina e seus papéis potenciais no desenvolvimento e câncer

Papelual da 5-hidroximetil-citosina como base estável do DNA e como intermediário na desmetilação do DNA

Agora sabemos que os níveis de 5hmC variam substancialmente entre diferentes tipos celulares e tecidos e são mais altos no cérebro, em particular nos neurônios . Como 5hmC é um produto de oxidação de 5mC, é claro que a formação de 5hmC a partir de 5mC diminui automaticamente os níveis de 5mC em qualquer posição de nucleotídeo ou mesmo em todo o genoma. Portanto, ficou imediatamente aparente que a conversão de 5mC em 5hmC poderia ser o primeiro passo em um caminho que conduzisse à desmetilação do DNA. Há evidências de vários sistemas experimentais de que este pode ser realmente o caso. O resultado final desta via de desmetilação é a remoção passiva ou activa da base modificada e/ou desaparecimento do grupo metilo da citosina no ADN (Figura 1). Na via de desmetilação passiva, a 5hmC não pode ser copiada pela metiltransferase de DNA de manutenção, DNMT1, uma enzima que propaga padrões de metilação pré-existentes e opera em locais de CpG hemimetílico . O processo ativo de desmetilação que utiliza 5hmC como intermediário é consideravelmente mais complicado. Um relatório sugeriu que o 5hmC pode ser convertido em citosina por metiltransferases de DNA . A desaminação do 5hmC produz 5-hidroximetiluracil , que pode ser removido por enzimas de reparação de excisão de base, incluindo a timina DNA glicosilase (TDG) e DNA glicosilase monofuncional selectivo de cadeia única (SMUG1) . No entanto, o quão eficazmente esse caminho é operativo in vivo é actualmente desconhecido. A oxidação gradual de 5hmC pelas proteínas TET produz 5-formilcitosina (5fC) e depois 5-carboxilcitosina (5caC) . Esta 5caC, que é detectável em níveis baixos no DNA, pode então ser removida por meio da correção da excisão de base catalisada pela atividade da proteína TDG de DNA glicosilase, ou por descarboxilação. Teoricamente, a via de descarboxilação deve ser favorável, pois não requer a quebra das ligações do DNA fosfodiéster, que ocorre durante a correção da excisão de base iniciada por TDG. No entanto, até à data, não foi identificada qualquer actividade enzimática para a etapa de descarboxilação, embora a descarboxilação pareça ocorrer.

Muitos tecidos acumulam níveis bastante substanciais de 5hmC, muito maiores do que seria de esperar se esta base fosse simplesmente um intermediário transitório numa via de oxidação sequencial que conduzisse à desmetilação do DNA. Portanto, o 5hmC pode ser um módulo epigenético que tem suas próprias propriedades bioquímicas de codificação. Esta função pode ser negativa ou repulsiva uma vez que a oxidação do grupo metilo durante a produção de 5hmC bloqueará a ligação de proteínas que de outra forma interagiriam com 5mC . Em alternativa, a sua função pode ser positiva ou instrutiva se existirem proteínas que se liguem especificamente a 5hmC. Até agora, várias proteínas diferentes têm demonstrado capacidade de reconhecer 5hmC, pelo menos in vitro, incluindo UHRF1 , MBD3 , MeCP2 , e várias outras identificadas por uma abordagem proteômica. No entanto, o papel biológico da sua ligação ao 5hmC ainda não é totalmente claro. A maioria destas proteínas também tem outras funções e, portanto, pode não ser exclusivamente projetada para interagir com 5hmC.

O papel da 5-hidroximetilcitosina no desenvolvimento e diferenciação de mamíferos

O papel funcional da 5hmC nos genomas de mamíferos ainda não está claro. No início do ciclo de vida dos mamíferos, após a fertilização dos oócitos pelos espermatozóides, a maior parte dos 5mC no genoma paterno (derivado de espermatozóides) é oxidada para formar 5hmC . Esta etapa de oxidação, que anteriormente se pensava refletir a verdadeira “desmetilação” do DNA, é específica do genoma paterno, enquanto o genoma materno (derivado de oócitos) permanece protegido da oxidação por Tet-catalisação. A oxidação do genoma paterno é catalisada pelo Tet3, codificado pelo único gene Tet expresso a níveis substanciais em oócitos e zigotos . A eliminação genética do Tet3 em camundongos resulta em oxidação do genoma paterno falhada, desenvolvimento comprometido e letalidade perinatal .

Uma outra transição de desenvolvimento importante envolve a desmetilação global do DNA em células germinativas primordiais (PGCs) que começa em torno do dia embrionário 8,5 a 9,5 e é concluída perto do dia embrionário 13,5. Os mecanismos de eliminação da metilação nos PGCs têm permanecido pouco claros e controversos. Há muito tempo que se supõe que a desmetilação activa do ADN independente da replicação é uma via-chave provavelmente envolvida nesta etapa . Contudo, dados mais recentes favorecem uma perda passiva de metilação causada pela falta de manutenção da metilação durante a replicação do ADN . Essa perda passiva de 5mC pode ser efetivamente iniciada pela conversão de 5mC em 5hmC . Tet1 e Tet2 são as oxidases de 5mC mais expressas em PGCs nesta fase . A descendência de ratos deficientes em Tet1 e Tet2 tem deficiências na desmetilação do DNA em genes impressos . Entretanto, os animais com deficiência de Tet1/2 de ambos os sexos eram férteis, com fêmeas com ovários menores e fertilidade reduzida. A eliminação do Tet1 e Tet2 pode produzir adultos viáveis, embora a maioria desses ratos morram durante a embriogênese ou ao redor do nascimento e apresentem vários defeitos de desenvolvimento . Os dados sugerem que a oxidação induzida por Tet1/2 em PGCs 5mC não é absolutamente necessária para produzir descendentes viáveis. A informação actualmente disponível sobre a desmetilação do ADN em zigotos e em PGCs ainda carece de uma análise mais específica de 5hmC ao nível da sequência de ADN, como pode ser conseguido, por exemplo, através da sequência de TAB . Espera-se que tais informações esclareçam o envolvimento global ou específico do local da formação de 5hmC na iniciação da desmetilação passiva (ou ativa) do DNA. A implicação anterior dos processos de reparação da excisão de base na reprogramação da linha germinal, que por si só representaria um risco tremendo para a manutenção da integridade do genoma se operasse a nível global, pode ter várias outras explicações. Em um cenário, a ocorrência da atividade de reparo da excisão de base pode ser explicada pela exigência de neutralizar reações espúrias de oxidação não direcionadas catalisadas pela atividade da Tet oxidase em guaninas em locais de CpG metilada (sendo a guanina a base de DNA mais suscetível à oxidação). Em outro cenário, 5hmC pode ser mais oxidado, talvez em seqüências específicas, por proteínas Tet para formar 5caC, que é então removido pela correção da excisão da base iniciada por TDG .

Porque 5hmC é mais abundante no tecido cerebral, tornou-se uma prioridade entender a função desta base modificada no cérebro. Por exemplo, no DNA do córtex cerebral humano, o nível de 5hmC é cerca de 1% de todas as citosinas ou 20 a 25% de todas as bases de 5mC . Isto corresponde a aproximadamente 6.000.000 bases de 5hmC por genoma haplóide. Estes níveis sugerem claramente que o 5hmC tem um papel funcional importante no cérebro dos mamíferos. Estudos relatados até agora mostraram que o 5hmC nos tecidos cerebrais é muito abundante dentro das regiões do gene, seja em promotores ou ainda mais dentro de regiões intragênicas, os chamados corpos gênicos . É concebível que a formação de 5hmC nos promotores, nas ilhas CpG ou nas costas (bordas) das ilhas CpG funciona de forma análoga a um processo de reparação para oxidar e eventualmente remover 5mCs introduzidos inadequadamente nessas regiões. A deposição de 5hmC em promotores ou corpos de genes muitas vezes correlaciona-se positivamente com a atividade gênica. O mecanismo de como o 5hmC associado ao corpo do gene aumenta os níveis de transcrição é atualmente desconhecido. Uma possibilidade é que a oxidação de 5mC libera um efeito repressivo sobre a transcrição, talvez neutralizando a transcrição espúria intragênica anti-senso. Outras explicações podem incluir o fato de que o 5hmC tem um efeito desestabilizador na estrutura do DNA que potencialmente favorece a abertura da dupla hélice pelo aparelho de transcrição.

5hmC, embora não reconhecido por várias proteínas ligantes de metil-CpG, incluindo MBD1, MBD2 e MBD4 , é capaz de ligar MeCP2 , uma proteína ligante de metil-CpG que é abundante no cérebro e que sofre mutação no distúrbio neurológico Síndrome de Rett . Estudos anteriores, utilizando o domínio de ligação metil-CpG (MBD) da MeCP2 em vez da proteína de comprimento total, não concluíram que a MeCP2 se liga a 5hmC . As razões para estas discrepâncias não são claras. A ligação entre MeCP2 e 5hmC no cérebro é de particular interesse uma vez que os níveis de 5hmC são mais altos no cérebro e MeCP2 é uma proteína abundante no cérebro atingindo níveis semelhantes aos da histona H1. Por estas razões, um papel mecanicista de 5hmC no cérebro pode ser antecipado por MeCP2 em todo o genoma e não em sequência.

Como mostrado recentemente, a formação de 5hmC é crítica para o desenvolvimento do cérebro. A base é abundante no desenvolvimento de neurônios nos quais seu nível aumenta em relação às células progenitoras neurais e onde ela se localiza especificamente nos corpos gênicos de genes importantes para a diferenciação neuronal. O Tet3 é mais altamente expresso no córtex cerebral de camundongos em desenvolvimento seguido pelo Tet2 e os níveis de Tet1 são muito baixos neste tecido. Um aumento nos níveis de Tet2, Tet3 e 5hmC na diferenciação dos neurônios coincide com a redução da Polycomb H3K27 metiltransferase Ezh2 e perda de H3K27me3 em genes críticos. A redução dos níveis de Tet2 e Tet3 ou o aumento da expressão de Ezh2 resulta em diferenciação neuronal incompleta ou bloqueada. Assim, a formação de 5hmC promove diferenciação neuronal modulando a expressão dos genes mais críticos nesta importante transição de desenvolvimento.

Perda de 5-hidroximetil-citosina no câncer

Os níveis de 5hmC no câncer são fortemente reduzidos em relação ao tecido normal correspondente que envolve o tumor . Utilizando a cromatografia líquida – espectrometria de massa, anti-5hmC anti-inflamações por anticorpos e imunohistoquímica, demonstramos perda de 5hmC associada ao tumor para cânceres de pulmão, cérebro, mama, fígado, rim, próstata, intestino, útero e melanoma. Outros investigadores confirmaram esta observação, mostrando perda de 5hmC em diferentes tipos de tumores sólidos. Além disso, a reintrodução de TET2 mostrou restaurar os níveis de 5hmC e diminuir o potencial metastático das células do melanoma . De forma impressionante, quando co-imuno-stained seções de tecido com anticorpos contra 5hmC e contra o antígeno Ki67, que é um marcador encontrado apenas em células em proliferação, observamos que 5hmC e Ki67 quase nunca estão presentes simultaneamente em uma única célula . A um nível de diagnóstico clínico, a análise imunohistoquímica combinada da perda de 5hmC e da presença de células Ki67-positivas poderia ser desenvolvida como um biomarcador para o diagnóstico do câncer. A falta ou forte redução de 5hmC nos tumores sugere que as células proliferantes perdem 5hmC. Na maioria dos casos, a massa tumoral a granel é esvaziada de 5hmC mesmo quando as células Ki67-positivas são raras, sugerindo que essas células tumorais tiveram um histórico de proliferação que levou à perda de 5hmC, que então não é restabelecida. A perda dependente da replicação de 5hmC reflete uma situação que lembra aquela em embriões pré-implantados, na qual a formação inicial de 5hmC no DNA paterno é seguida pela perda ou diluição desta marca, dependente da replicação. Da mesma forma, o conteúdo global de 5hmC diminui rapidamente à medida que as células do tecido normal se adaptam à cultura celular . A explicação mais simples é que a oxidação de 5mC produz um local de CpG hemi-hidroximetilado no DNA que não é reconhecido pelo DNMT1 durante a replicação do DNA. Tal explicação é consistente com estudos in vitro que mostram que o DNMT1 é incapaz de operar em locais de CpG que contêm 5hmC . No entanto, também são possíveis outras explicações para a redução de 5hmC no cancro. Os níveis de proteínas TET podem ser inferiores no tecido tumoral do que na sua contraparte de tecido normal correspondente. Embora não tenhamos observado diferenças consistentes no nível de RNA para TET1, TET2 ou TET3 em tumores pulmonares e cerebrais em relação ao tecido normal, outros relataram níveis mais baixos de expressão do gene TET no câncer. Uma possibilidade adicional é que as células cancerígenas contêm vias metabólicas comprometidas que estão envolvidas na produção do co-fator da atividade TET, 2-oxoglutarato (ver abaixo).

Mutação de TET2 no câncer humano

TET1 pertence a uma família de proteínas caracterizada como promovendo a conversão de 5mC para 5hmC no DNA de mamíferos . Existem três membros identificados da família que pertencem à família TET: TET1, TET2, e TET3. A TET1 está localizada no cromossomo humano 10q21.3, enquanto a TET2 está localizada no cromossomo 4q24 e a TET3 está no cromossomo 2p13.1. A enzima TET1 consiste em um domínio de ligação de DNA CXXC do dedo de zinco, uma região rica em cisteína e um domínio 2-oxoglutarato e ferro (II) dio-oxigenase dependente (2OGFeDO). TET3 também contém um domínio N-terminal CXXC . Entretanto, o gene TET2 sofreu uma inversão do gene cromossômico durante a evolução, separando assim seu domínio CXXC do catalítico e criando um novo gene de domínio CXXC chamado IDAX/CXXC4, que codifica um regulador negativo do TET2 . Com base nos perfis EST e matrizes de expressão, o TET1 mostra a maior expressão durante a embriogênese e não mostra expressão relevante nos tecidos adultos. O TET2 é expresso principalmente em células hematopoiéticas e o TET3 parece ser ubíquamente expresso em tecidos humanos adultos.

Leucemia é uma doença onde, durante a diferenciação hematopoiética normal das células-tronco, a expansão clonal das células precursoras hematopoiéticas na medula óssea é afetada em um determinado estágio de diferenciação, causando um desequilíbrio entre diferenciação e auto-renovação. A expansão inapropriada das células progenitoras hematopoiéticas é causada principalmente por um bloqueio da maturação celular. A síndrome mielodisplásica (MDS) na hematopoiese é caracterizada por citopenia (baixa contagem de células sanguíneas), hematopoiese ineficaz em uma ou outra linhagem celular e um risco aumentado de transformação em leucemia mielóide aguda (LMA). Na LMA, o crescimento rápido de leucócitos anormais na medula óssea leva a um bloqueio na produção de várias células de outras linhagens celulares.

TET2 foi encontrado mutado em pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMP), MDS, AML e leucemia mielomonocítica crônica (CMML), e é o gene mais comumente mutado no MDS . Mutações do TET1 ou TET3 não são observadas no MDS nem a mutação do TET2 se correlaciona com várias outras mutações comuns conhecidas . Curiosamente, as mutações da isocitrato desidrogenase 1/2 (IDH1/2) raramente são encontradas juntamente com as mutações do TET2, mas têm efeitos semelhantes aos das mutações do TET2 em células-tronco hematopoéticas (HSCs) . Enquanto as mutações TET2 estão associadas à redução da sobrevivência global na LMA em comparação com pacientes com TET2 do tipo selvagem, as mutações TET2 em pacientes MDS e MPN promovem a progressão para LMA. O gene TET2 é composto por um total de onze exões, traduzindo-se num produto de proteína de aminoácidos de 2002 . Mutações do tipo TET2 em cânceres mielóide têm sido mais comumente observadas nos exons 3a e 10, que são os exons mais longos . Tanto as células multipotentes como as células progenitoras comprometidas na linhagem hematopoiética são alvo das mutações TET2 na NMP, o que implica que a TET2 desempenha um papel importante na mielopoiese . Deleções de TET2 e perda de heterozigosidade ou disomia uni-parental foram observadas em (9%) pacientes MDS/AML com TET2 mutado, onde é provável que o alelo do tipo selvagem se perca durante a recombinação, permitindo que o TET2 mutado promova uma perda do fenótipo de função. Kosmider et al. observaram que 50% dos pacientes com TET2 mutante tinham defeitos genéticos que visavam as duas cópias do TET2. Mutações no TET2 parecem levar à perda de função, sugerindo que ele pode desempenhar um papel supressor do tumor.

A compreensão das implicações subjacentes da falta de função do TET2 mutante e seu papel nas malignidades mielóides é uma prioridade de pesquisa atual. Vários laboratórios geraram modelos condicionais de ratos Tet2 knockout em que exões Tet2 críticos foram alvo. Moran-Crusio et al. observaram que camundongos Tet 2-/- desenvolveram esplenomegalia com 20 semanas de idade, mostrando fenótipos semelhantes aos observados em pacientes humanos com CMML com TET2 mutante. Os dados dos diferentes modelos de camundongos levaram a observações semelhantes. A eliminação do Tet2 não é letal embrionária. Uma observação importante feita por Moran-Crusio et al. e Ko et al. é que células-tronco hematopoiéticas de camundongos Tet2-/- têm uma capacidade aumentada de repovoar o compartimento hematopoiético in vivo durante ensaios de reconstituição competitivos com competição de HSCs de células Tet2+/+. A análise de vários órgãos de ratos Tet2-/- mostrou que a perda de Tet2 não é compensada por um aumento na expressão de Tet1 ou Tet3 . Os níveis de 5hmC estão significativamente diminuídos na medula óssea e no baço dos ratos Tet2-/-. Os ratos Tet2-/- mostram um aumento das HSC com um ligeiro aumento dos progenitores mielóides, enviesando a hematopoiese para os destinos das células monócitos/macrófagos . Sugere-se que um Tet2 ativo regularia a hematopoiese normal para assegurar a distribuição adequada da linhagem e diferenciação controlada das HSCs. De particular interesse é o efeito das mutações de TET2 em níveis e padrões de 5mC no genoma. No entanto, os dados atuais estão longe de ser claros. Enquanto um relatório indicou que a mutação TET2 na LMA está associada a um fenótipo de hipermetrotilação do DNA, outros dados sugerem que amostras de medula óssea de pacientes com mutações TET2 têm níveis baixos de 5hmC e hipometilação do DNA. A situação é complicada pelo fato de que as neoplasias malignas hematopoiéticas são frequentemente caracterizadas por mutações em vários modificadores epigenéticos incluindo EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A, e ASXL1, obscurecendo assim potencialmente qualquer associação direta. Por exemplo, em um estudo, oito dos onze pacientes com mutações DNMT3A (73%) no linfoma de células T também tiveram mutações TET2 .

Mutações nas vias de co-fator

5mC oxidases são enzimas dependentes de 2-oxoglutarato (Figura 2). Este co-fator é produzido no ciclo do ácido tricarboxílico a partir do isocitrato pela enzima IDH. Curiosamente, vários tipos de tumores humanos contêm mutações no gene IDH1. As mutações do IDH1 são particularmente freqüentes nos gliomas de grau II e III, onde são encontradas em até 70% dos pacientes. Mutações no IDH1 e IDH2 também são observadas em leucemias mielóides e algumas outras neoplasias malignas, mas com uma frequência menor . Essas mutações IDH1 não estão espalhadas pelo gene, mas são quase exclusivamente encontradas na posição de aminoácidos 132. Este achado sugere que esta proteína mutante IDH1 em particular tem um ganho de propriedade funcional. Uma descoberta surpreendente foi que o códon IDH1 132 arginina para histidina mutante produz o oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG) como produto de reação ao invés do 2-oxoglutarato . Parece que a reação de oxidação do isocitrato realizada por este mutante é incompleta e produz apenas 2HG. Além disso, o 2HG é um inibidor competitivo de muitas, se não todas, as atividades enzimáticas dependentes do 2-oxiglutarato. As proteínas TET representam uma classe de tais enzimas, e foi demonstrado que 2HG é um inibidor de TET1 e TET2 .

Um correlato interessante de ter o IDH1 mutante em tumores de glioma é que os tumores IDH1-mutantes estão quase sempre associados a mudanças abundantes na metilação do DNA em todo o genoma, como indicado pela hipermetrotilação generalizada das ilhas CpG . Este fenótipo tem sido referido como fenótipo de metilator da ilha CpG (ou CIMP) . É tentador presumir que a CIMP em gliomas mutantes IDH1 está ligada a uma falha de produção de 5hmC nestes tumores porque a actividade TET é comprometida pelo 2HG. De fato, a introdução experimental de uma construção mutante do IDH1 em astrocitos humanos levou ao surgimento de um fenótipo do tipo CIMP . Além disso, em camundongos com knock-in condicional nos quais o R132H mutante Idh1 mais comum foi inserido no locus Idh1 endógeno e foi expresso em células hematopoiéticas, foi observada hipermetrotilação do DNA. Entretanto, em uma comparação direta de níveis de 5hmC no DNA entre gliomas do tipo mutante IDH1 e do tipo selvagem IDH1, não observamos diferenças substanciais entre essas duas categorias de tumores cerebrais. Portanto, é preciso ter em mente que o IDH1 mutante e seu produto metabólico 2HG não só afetam as enzimas TET, mas também inibem muitas desmetilases de lisina que dependem do 2-oxoglutarato e outras enzimas dependentes do 2-oxoglutarato. A disfunção destas desmetilases de lisina pode ter um impacto secundário nos padrões de metilação do ADN nas ilhas CpG.