A RNA produzindo hidrogel de DNA como plataforma para um sistema de interferência de RNA de alto desempenho

Síntese e caracterização do I-gel

Os quatro oligonucleotídeos de X-DNA (fios de DNA X01-X04) foram sintetizados comercialmente pela Integrated DNA Technologies (Skokie, IL, EUA). As sequências de X-DNA (Tabela Complementar 5) foram desenhadas, preparadas e caracterizadas por seguir os mesmos procedimentos descritos na literatura com ligeiras modificações10,13. Os fios de DNA liofilizado na escala 1 μmol foram coletados por centrifugação a 14.000 g durante 15 s à temperatura ambiente. Cada fita de DNA foi ressuspendida a 1,0 mM de concentração em tampão 1x TE (pH 8,0). Cada tubo foi agitado e misturado usando MULTI-THERMTM (Benchmark Scientific, NJ, EUA) a 1500 rpm durante ~3 h para dissolver completamente os oligonucleotídeos liofilizados. No total, 0,05 μmol (50 μl) de cada fio de DNA foi combinado a um tubo de 1,5 ml, e foi adicionada água livre de nucleotídeos com o volume total da mistura de oligonucleotídeos a 500 μl. 100 μl de mistura de oligonucleotídeos foi distribuído em tubos de 0,5 ml. Os tubos foram colocados em um termociclador (Bio-Rad, CA, EUA). Os quatro tipos de oligonucleotídeos (X01 ~04) foram recozidos com as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C durante 10 min; e 65 °C durante 2 min, 60 °C durante 5,5 min, diminuir 1 °C mantendo 1 min a essa temperatura, 20 °C durante 30 s, e diminuir para 4 °C para estabilização e armazenamento do X-DNA. Depois, para a troca de tampão, a solução recozida de X-DNA (500 μl) em uma unidade de filtragem (corte de 3 kDa Mw) para microcentrifugação foi centrifugada durante 6 h a 15.000 g e 4 °C para reduzir o volume de solvente. A unidade de filtragem foi transferida para um tubo de centrifugação fresco. No total, 100 μl cerca de 4 °C de água sem núcleo foi adicionada à unidade de filtragem. A unidade de filtragem foi centrifugada durante 4 h a 15.000 g e 4 °C para enxaguar X-DNA dos sais restantes. O módulo de filtro cortado deve ser colocado de cabeça para baixo no tubo e centrifugado a 2000 g durante 3 min a 4 °C. A adição de água sem núcleo e a centrifugação foram realizadas mais duas vezes usando o mesmo tubo de centrifugação para remover completamente o sal residual do X-DNA. O volume final da solução de X-DNA será de ~300 μl. O plasmídeo de expressão siRNA (I-plasmid) foi adquirido e preparado pela Cosmo Genetech (Seul, Coreia do Sul). Para construir os I-gels, os I-plasmídeos foram linearizados usando a enzima de restrição BamHI. O tamanho do gene siRNA era de 66 bp com o espaçador (ou 498 bp com o promotor T7) (ver Figura Suplementar 4 para o mapa I-plasmid). As quantidades de DNA das amostras foram determinadas a partir do seu valor de absorção UV/Vis usando um BioSpectrometro (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). O X-DNA e plasmídeos lineares foram primeiramente misturados a uma razão molar pré-determinada na presença de ligase de DNA T4 (Promega, Madison, WI, EUA) para sintetizar o Dgel. Para uma relação X-DNA:I-plasmídeo de 1500:1, utilizamos 10,5 μL de 75 μM X-DNA e 5,25 μL de 100 nM plasmídeo em um volume de reação de 30 μL. Para o experimento Blank-gel, a mesma quantidade de material X-DNA como no I-gel foi ligada com ligase de DNA T4. 10 µL de cada amostra foi misturado com 2 µL de tampão de carga de gel e electroforese num gel de agarose 0,7 ou 2% a 100 V durante 60 min. Todos os DNAs (X-DNA, I-plasmid, Blank-gel e I-gel) foram confirmados por eletroforese em gel de agarose (Figuras Suplementares 3, 11, 18). Os Dgels sintetizados foram dessalgados duas vezes usando filtros centrífugos microtubulares de corte de Amicon 3-kDa Mw. Para a microscopia eletrônica de varredura (SEM), as amostras foram liofilizadas em um liofilizador de zona livre (Labconco, Kansas City, MO, EUA) até que toda a água tivesse sido removida. As amostras secas foram rachadas para revelar as suas superfícies frescas. Após serem revestidas com uma camada de Pt de 2~ 3 nm durante 100 s, as morfologias destas superfícies de hidrogel foram observadas com uma ampliação de ~50.000× usando um microscópio electrónico de varrimento S-3500N (Hitachi, Tóquio, Japão) a uma tensão de aceleração de 15 kV (Figura Complementar 19).

Teste de estabilidade do gel

Amostras pares foram preparadas para cada um dos plasmídeos e gel I livre. Em cada amostra, 2 µL de I-plasmid livre (57 ng) ou I-gel (1:1500 gel contendo 57 ng de I-plasmid) foram diluídos em 12 µL de água destilada, então 4 µL de tampão de transcrição otimizado 5 × foram adicionados e tratados com 3,33 × 10-5 unidades de DNase I (No. M6101; Promega) a 20 µL de volume final, seguido de incubação a 37 °C para 0, 1, 4, 12, 24, e 48 h, respectivamente. Após a incubação, as amostras de 20 µL foram separadas em duas alíquotas de 10 µL, uma para eletroforese e outra para seguir a transcrição. Em cada uma das alíquotas, a reação de desnaturação foi terminada pela adição de 1 µL de solução de parada de DNase RQ1 e incubação por 10 min a 65 °C. Posteriormente, 10 µL de cada amostra foram misturados com 2 µL de tampão de carga de gel e electroforese num gel de agarose a 2% a 100 V durante 60 min (Figura Suplementar 13). Outra alíquota de cada amostra foi usada para a reação de transcrição para demonstrar a eficiência da transcrição do I-gel após a reação de digestão. shRNAs foram transcritos do I-gel ou modelos de I-plasmídeo livre (0, 24, 48 h) usando o kit de transcrição (Riboprobe; Promega) seguindo as instruções do fabricante. Os shRNAs obtidos foram quantificados por RT-qPCR como descrito em Total RNA preparation and reverse transcription and Real-time PCR and data analysis sections (Supplementary Table 4).

Expression and inhibition analyses of proteins

Coupled transcription and translation kits (1-Step Human Coupled IVT Kit – DNA, Catalog no. 88882) foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), e as reações foram realizadas seguindo os procedimentos sugeridos pelo fabricante. Em resumo, o lisado celular HeLa, proteínas acessórias, mistura de reação e pcDNA3.1( + ) plasmídeo IRES GFP (0.5 μg/μL; No. 51406; Addgene, Cambridge, MA, EUA) foram misturados em um plasmídeo 12.5:2.5:5:2 (v/v) e incubadas a 30 °C durante 1, 2, 4 e 6 h. Após os tempos de reacção indicados, as soluções de amostra foram incubadas durante 24 h a 4 °C para interromper a reacção e garantir um tempo suficiente de dobragem da proteína. Para avaliar a eficiência da interferência, foi adicionado I-plasmid livre ou I-gel ao lisado de células na presença de 1000 ng de plasmid GFP. Nos experimentos de controle da condição otimizada de I-gel contendo 57 ng de I-plasmid (17,5 nmol), shRNA mexido (17,5 nmol e 1,75 μmol; 1 eq e 100 eq para a quantidade de I-plasmid, respectivamente) (SN-1003; Bioneer, Seul, Coreia), mistura de plasmid mexido (17.5 nmol; mistura de plasmídeo de expressão de shRNA mexido; Cosmo Genetech), gel de plasmídeo mexido (mistura de plasmídeo mexido enzimaticamente reticulado com X-DNA), o componente I-gel (apenas X-DNA, apenas I-plasmídeo, ou estas misturas sem reticulação enzimática; ou seja, sem formação de gel), ou Blank-gel (reticulação enzimática de X-DNAs apenas) foram adicionados diretamente à solução de reação de expressão GFP. Todas as reacções foram realizadas pelo menos três vezes. Salvo indicação em contrário, o volume da reacção foi mantido em 25 μL. Os espectros de fluorescência foram analisados usando um espectrofluorofotômetro (FluoroMate FS-2; SCINCO Co., Ltd., Seul, Korea) para determinar o nível de expressão de GFP na solução de lisado celular.

Preparação total de RNA e transcrição reversa

Como um controle spike-in, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL; No. 59000; Norgen Biotek Corp., Thorold, ON, Canadá) foi adicionado a todos os lisados pré-expressos de células (20 µL) antes da extração de RNA. Então, o RNA total foi extraído de 23 µL do lisado usando TRIzol Reagent (Ambion, Thermo Fisher Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA total extraído foi dissolvido em 10 µL de água tratada com DEPC (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Então, 2 µL de RNA total foi poladenilado com 1 mM ATP em 1 × tampão de polimerase de Pol(A) contendo 5 U de Escherichia coli polimerase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 37 °C durante 30 min numa mistura de reacção de 20 µL. Para transcrição reversa, 4 µL do RNA com cauda foi misturado com 1 pmol de primário RT e 0,5 mM de mistura de dNTP e, em seguida, composto até um volume de 13 µL com água tratada com DEPC. A mistura foi aquecida a 65 °C durante 5 min e depois rapidamente arrefecida em gelo. A mistura de reação foi então composta até um volume final de 20 µL pela adição de 5 mM de ditiotreitol, 1 × tampão de primeira linha, inibidor de 40 U RNase, e 200 U SuperScript III Reverse Transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e incubada a 50 °C durante 1 h, seguida de inativação enzimática a 70 °C durante 15 min. As sequências de iniciadores RT (ver Tabela Complementar 5) foram concebidas para a síntese de cDNA a partir da sequência de RNA. O primer utilizado foi o adaptador RACE 3′, que é fornecido no kit FirstChoice RLM-RACE (Ambion, Thermo Fisher Scientific). Todos os primers foram sintetizados pela Cosmo Genetech, exceto o primer forward cel-miR-39 (Norgen Biotek Corp.). A taxa de recuperação do RNA em cada solução de lisado foi estimada a partir da diferença entre o valor de CT do controlo de spike-in obtido e o do cel-miR-39 de referência (não procedido com o processo de extracção).

Real-time PCR and data analysis

As quantidades de shRNA e mRNA GFP foram quantificadas pelo qPCR utilizando o Sistema de PCR em Tempo Real StepOne (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O qPCR de cada amostra foi realizado em um volume total de 20 µL com 2 µL de cDNA, 10 µL de 2 × Maxima SYBR Verde qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific), e 10 pmol de cada primer. A amplificação foi realizada com as seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C durante 10 min; e 30 ciclos de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, e 72 °C durante 30 s. O qPCR também foi realizado com cel-miR-39 como RNA de referência para obter a taxa de recuperação do RNA total em cada amostra. O protocolo qPCR foi o mesmo descrito acima nesta seção, com exceção dos primers utilizados, que foram as 22h10 de um primer reverso comum (igual ao primer reverso do shRNA) e o primer cel-miR-39 forward. A curva de fusão de cada produto de DNA amplificado foi obtida medindo a mudança de intensidade de fluorescência do corante SYBR Green por seis vezes por amostra, enquanto aumentava a temperatura de 60 °C para 95 °C a uma taxa de + 0,3 °C/s após a conclusão do qPCR. Os primers específicos para qPCR foram desenhados usando o programa Primer3 (http://primer3.ut.ee/) (Tabela Complementar 5). A expressão relativa dos alvos foi determinada utilizando o método comparativo 2-ΔΔCT. A quantidade relativa de GFP mRNA também foi confirmada através da medição da intensidade da banda no gel de agarose a 2%. A amplificação do cDNA foi realizada com as mesmas condições de PCR e programa utilizado para o qPCR descrito acima, excepto para o número do ciclo de PCR (20 para o mRNA de GFP).

Calibração e quantificação da quantidade absoluta de RNA

Curvas padrão para a concentração de RNA e valor de CT foram obtidas usando cada material padrão de RNA. Para o shRNA, a curva padrão foi obtida usando shRNAs sintetizados adquiridos da Integrated DNA Technologies. Para o mRNA GFP, a curva foi obtida usando o mRNA GFP extraído de um kit de transcrição (Riboprobe; Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de RNA do shRNA padrão foi informada pela Integrated DNA Technologies, enquanto que a do mRNA padrão GFP extraído foi determinada a partir do seu valor de absorção UV/Vis usando o BioSpectrometro. Os RNAs padrão obtidos foram convertidos para cDNA por transcrição reversa, conforme descrito acima na seção “Total RNA preparation and reverse transcription”. Depois disso, o cDNA foi diluído 10, 100, 1000 e 10.000 vezes, e depois o qPCR foi repetido três vezes, e os valores de TC obtidos foram usados para obter uma curva padrão. Os valores de TC obtidos do RT-qPCR foram convertidos para as concentrações iniciais de RNA nos lisados de células através de um processo de calibração (Figura Complementar 6). A quantidade absoluta final de RNA foi determinada multiplicando-se cada taxa de recuperação do RNA (%) e o valor da quantidade de RNA da curva de calibração (Tabelas Suplementares 1, 2).

Etiquetagem celular com Cy5-I-gel

Células Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) foram obtidas do Korea Cell Line Bank (Seul, Korea) e mantidas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora umedecida e mantida com CO2 (5%). As células MDCK expressando GFP (MDCK-GFP) foram preparadas através da transfecção do vector pEGFP-N1 para as células com o uso de reagentes Lipofectamínicos (Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. Posteriormente, classificamos as células emissoras de GFP usando o sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA). Ao longo de toda a pesquisa, as células foram testadas negativas para contaminação por micoplasma. As células cultivadas de MDCK-GFP em placas de 24 poços com lamelas de cobertura (50.000 células por poço) coincidiram com as células Cy5-I-gel (Cy5-conjugated I-gel) contendo fios de sequência de DNA X01 conjugado com Cy5 (correspondente a 2.625 μM X-DNA; Tecnologias Integradas de DNA) em meio livre de soro durante 4 h. Para preparar o Cy5-I-plasmid, o Cy5-dsDNA (Cy5-conjugated dsDNA) foi primeiramente preparado pelo recozimento do Cy5-conjugated X01 (com uma ponta adesiva adicional 5′-p-GATC) e sua contraforte complementar (5′-CGA GTA GGT ACG GAT CTG ACC GCT ATT CAT CGG TCG-3′). Em seguida, o Cy5-dsDNA e o I-plasmid foram misturados e ligados a uma razão molar de 5000:1. O excesso de Cy5-dsDNA não ligado foi removido por centrifugação (12.400 g, 4 °C, 60 min) usando filtros centrífugos microtubulares Amicon (corte de 50 kDa Mw) por 4-5 vezes. O Cy5-shRNA (Cy5-conjugated shRNA) foi sintetizado comercialmente (Tecnologias Integradas de DNA). Para os conjuntos Cy5-I-plasmid e Cy5-shRNA, as células foram coincididas com 2,625 nM de cada amostra em meio livre de soro durante 4 h. Para os conjuntos Lipofectamina-Cy5-I-plasmid e Lipofectamina-Cy5-shRNA, a Lipofectamina e a amostra conjugada com Cy5 foram complexadas electrostaticamente misturando-as numa razão molar de 1:1 para uma concentração da solução final de 2,625 μM Lipofectamina e 2,625 μM substrato. Em seguida, as células foram coincididas com a 2.625 μM Lipofectamina-Cy5-I-plasmid ou Lipofectamina-Cy5-shRNA em meio livre de soro durante 4 h, respectivamente. No caso do controle apenas celular, as células foram coincubatadas com DMEM livre de soro contendo 1% (v/v) de penicilina (HyClone). Após 4 h de coincidência, todas as amostras foram lavadas duas vezes com tampão fosfato salino (PBS) (0,1 M, pH 7,4) e as células foram ainda incubadas durante 6 h em um meio de crescimento contendo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS; HyClone) e 1% de penicilina para garantir recuperação celular e tempo de absorção suficiente. As células cultivadas foram fixadas com formaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente e lavadas três vezes com tampão PBS (0,1 M, pH 7,4). Para imagens de microscópio, as lamelas com as células anexadas foram montadas em lâminas de vidro usando um meio aquoso de montagem com um agente antifading. As imagens fluorescentes foram gravadas usando um microscópio Zeiss Axioplan 2, e as imagens foram tiradas usando uma câmera Zeiss Axiocam HR.

GFP experiência de silenciamento de genes usando o I-gel

First, o I-gel contendo 262,5 µM X-DNA e 175 nM I-plasmid foi incubado com 300 U de RNA polimerase T7 (Thermo Fisher Scientific) por 15 min à temperatura ambiente. Após a incubação, a amostra de I-gel foi diluída até 100 vezes em DMEM sem soro contendo 1% de penicilina. Em seguida, 1/6 vezes o volume do complexo I-gel/polimerase foi adicionado a cada poço de uma placa de 24 poços com lamela que tinha sido pré-placada com células MDCK-GFP (20.000 células por poço) durante 24 h. Para o I-plasmid, mistura de plasmídeo mexido e conjuntos de gel plasmídeo mexido, as células MDCK-GFP foram co-cultivadas com a mesma quantidade molar de cada plasmídeo e RNA polimerase T7 como no caso do I-gel. Para medir o efeito RNAi do shRNA nu e Lipofectamina-shRNA, 100 vezes mais de cada amostra de RNA foi usado em relação ao número de plasmídeos I, levando em consideração a taxa de expressão do shRNA do gel I, calculada a partir do experimento do lisado celular. Para os conjuntos de shRNA nu e shRNA codificado, as células MDCK-GFP foram coincididas com 175 nM da amostra de RNA. As amostras de lipofectamina complexadas foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Para os conjuntos de mistura lipofectamina-I-plasmídeo e lipofectamina-plasmídeo misturado, a lipofectamina e cada amostra de plasmídeo foram complexados eletrostaticamente misturando-os numa razão molar de 5:1 para obter uma concentração final da solução de 8,75 nM de lipofectamina e 1,75 nM de substrato plasmídeo. Para o conjunto lipofectamina-shRNA, a lipofectamina e o shRNA livre foram eletrostaticamente complexados misturando-os numa razão molar de 5:1 para obter uma concentração final da solução de 875 nM lipofectamina e 175 nM shRNA. As células MDCK-GFP foram incubadas em meio livre de soro durante 4 h. Para o conjunto celulósico, apenas as células MDCK-GFP foram incubadas em meio livre de soro durante 4 h, sem nenhuma amostra. Todas as amostras foram lavadas após o período de coincidência de 4 h, e as células foram adicionalmente incubadas durante 48 h com o meio de crescimento (DMEM contendo 10% (v/s) de FBS e 1% de penicilina) para avaliar o efeito de silenciamento do RNA a 37 °C abaixo de 5% de CO2. As células foram então fixadas com formaldeído a 4% durante 10 min à temperatura ambiente e lavadas com tampão PBS (0,1 M, pH 7,4). Para a imagem microscópica, as células de cobertura foram montadas em lâminas de vidro usando um meio de montagem aquoso com um agente antifading.

Análise de expressão do gene por PCR quantitativa em células vivas

Todas as amostras foram tratadas e incubadas em cada meio de células na mesma quantidade e na mesma condição usada no experimento de silenciamento de genes GFP descrito anteriormente usando a seção I-gel. Após a incubação, o meio celular foi aspirado das placas de cultura celular e as células MDCK-GFP foram lavadas uma vez com tampão PBS e trypsinizada para destacar as células em cada poço da placa. As células destacadas foram diluídas com tampão PBS para desativar a tripsina, sendo então coletadas em um microtubo de 1,5 mL e granuladas por centrifugação (180 g, 5 min). O sobrenadante foi removido e as células foram diluídas com 20 µL de tampão PBS. A solução de suspensão celular (20 µL) foi tratada com 1 mL de TRIzol Reagente, 3 µL de cel-miR-39 (33 fmol/µL), e 200 µL de solução de clorofórmio. A extracção subsequente do RNA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Para quantificar a quantidade relativa de GFP mRNA e shRNA a nível celular, todos os qPCRs dos preparados de amostra foram realizados no mesmo método descrito nas seções “Total RNA preparation and reverse transcription” e “Real-time PCR and data analysis”.

Cell imaging analysis for pixel intensity quantification

Por processamento da imagem celular, os dados foram conduzidos usando o programa MATLAB (The MatWorks, Inc., Beltsville, MD, USA). As imagens de fluorescência bruta foram importadas para MATLAB, e cada pixel nas imagens foi convertido para cada componente da matriz. A distribuição das intensidades de fluorescência de cada componente foi graficamente representada por um histograma. Todo o conjunto de dados foi dividido em 256 intervalos.

Análise de classificação de células ativadas por fluorescência

As células foram lavadas uma vez com 1 mL de PBS seguido pela aspiração do meio de crescimento a partir das placas de cultura celular. Em seguida, as células foram descoladas da placa através do tratamento com tripsina. As células descoladas foram recolhidas num tubo de 15 ml seguido de centrifugação resultando num granulado (180 g, 3 min). A solução sobrenadante de tripsina foi removida e o sedimento celular foi lavado duas vezes usando 2 mL de PBS. As células foram ressuspendidas em PBS para ser uma concentração de 50.000 células/mL. Em seguida, as amostras foram preparadas fixando as células em solução de formaldeído a 1% durante 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas para intensidade de fluorescência GFP usando o sistema FACSCanto II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA).

Níveis de viabilidade relativos em condição escura

Uma suspensão de células MDCK-GFP (5000 células por poço) foi dispensada em uma placa de 96 poços (Corning Inc., Corning, NY, EUA) e incubada por 1 dia a 37 °C abaixo de 5% de CO2. Uma vez que as células tinham se fixado à placa, elas foram coincubatadas com diferentes concentrações de I-gel (correspondente à concentração de X-DNA) no meio de crescimento (DMEM contendo 10% (v/v) de FBS e 1% de penicilina) no escuro. O I-gel foi composto por uma razão molar X-DNA:I-plasmídeo de 1500:1. Estas amostras foram incubadas durante 6, 24 e 48 h a 37 °C abaixo de 5% de CO2. No final de cada tempo de incubação, o Kit de Contagem de Células-8 (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japão) foi adicionado às amostras de acordo com as instruções do fabricante. Após mais 1 h de incubação, a absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas. Os resultados desta medida foram expressos como a relação entre a absorvância da amostra e a das células de controle negativo sem incubação da amostra.

Análise estatística

Análise estatística foi realizada com o software Prism 7.05 (GraphPad Software) para o teste t de Student, ANOVA unidirecional com comparações múltiplas de Bonferroni pós-teste. O pós-teste de comparações múltiplas de Holm-Bonferroni foi realizado com o software Bonferroni de comparações múltiplas pós-teste do Prism 7.05 (Software GraphPad)30. O teste de normalidade foi calculado através do teste Shapiro-Wilk. Nos resultados do teste de Shapiro-Wilk, os dados foram distribuídos aproximadamente normalmente. A significância estatística é indicada como *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001,