ABT-263: Um Inibidor Familiar Bcl-2 Potente e Oralmente Biodisponível

Resultados

ABT-263 é um inibidor familiar Bcl-2 disponível oralmente. As características estruturais do ABT-737 que conferem propriedades medicamentosas indesejáveis resultam de elementos de desenho essenciais para a inibição de uma grande superfície, interação proteína-proteína hidrofóbica e redução da ligação sérica de albumina (4-6). Para melhorar a eficácia oral desta molécula relativamente grande (MW >800), foi necessário um equilíbrio cuidadoso entre afinidade do alvo, potência celular, e absorção oral. Foram identificados três locais-chave ao longo da espinha dorsal do ABT-737 que afetam o equilíbrio de carga, metabolismo e absorção oral (Fig. 1). Analógicos incorporando modificações nestas posições foram otimizados para maximizar a relação farmacocinética/farmacodinâmica entre exposição oral em animais e eficácia em linhas de células tumorais humanas. Estes esforços resultaram na identificação do ABT-263.

ABT-263 mantém alta afinidade para Bcl-xL, Bcl-2 e Bcl-w, que está abaixo do limite de detecção do ensaio de polarização de fluorescência (Ki ≤1 nmol/L), mas liga-se mais fraca para Mcl-1 e A1 (Tabela 1). Este padrão de seletividade é similar ao do seu predecessor ABT-737 e da proteína BH3 apenas Bad (12). A afinidade subnanomolar do ABT-263 para Bcl-xL foi confirmada por um ensaio de transferência de energia por ressonância de fluorescência mais sensível, resolvido no tempo, que mostra que o enantiômero (um estereoisômero com a configuração oposta do grupo morfolinoetílico, usado como controle menos ativo) é ∼40-dobrado menos potente.

O perfil farmacocinético do ABT-263 é caracterizado por baixos valores de depuração de plasma e baixos volumes de distribuição em rato, rato, cão e macaco, com meia-vida de eliminação de plasma após dose i.v. de 4,6 a 8,4 horas (Tabela Suplementar S1). A biodisponibilidade após gavagem oral foi de ∼20% em todas as quatro espécies. Devido à sua baixa solubilidade aquosa, o ABT-263 apresenta uma taxa de dissolução prolongada – absorção oral limitada. A administração de ABT-263 em formulações à base de lipídios, nas quais o composto é significativamente mais solúvel, produz maior absorção com biodisponibilidade próxima a 50% e uma meia-vida de eliminação oral de 8,9 horas em cães. Uma curva representativa da concentração de drogas plasmáticas após a dosagem i.v. ou p.o. em cães é mostrada na Fig. Suplementar S1.

ABT-263 exibe citotoxicidade baseada em mecanismo. Um número de pequenas moléculas miméticas de BH3 tem sido relatado para ligar membros da família Bcl-2 com afinidade modesta e induzir apoptose em linhas de células tumorais (21-23). Entretanto, muitos desses agentes mostraram recentemente matar células de forma independente do Bax/Bak, questionando a relevância funcional de sua fraca afinidade para as proteínas Bcl-2 e os verdadeiros mecanismos de ação para essas moléculas (14). Portanto, sentimos a importância de demonstrar de forma robusta que a apoptose induzida pela ABT-263 foi o resultado direto da inibição das proteínas da família Bcl-2. Primeiro, a atividade celular da ABT-263 foi avaliada na linha de células murinas pro linfocitárias FL5.12 interleucina-3 (IL-3)-dependente. A retirada da IL-3 induz apoptose FL5,12, em parte pela regulação dos fatores pró-apoptóticos Bim e Puma (24, 25). A sobreexpressão da Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) ou Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) protege contra os efeitos da retirada da IL-3 por sequestro de Bim e Puma (25). ABT-263, mas não o enantiómero, inverte a protecção conferida pela sobreexpressão do Bcl-2 ou Bcl-xL (EC50 = 60 e 20 nmol/L, respectivamente; Fig. 2A). O ABT-263 foi ineficaz em provocar a morte celular na presença de IL-3, onde as células FL5,12 não estavam sujeitas a estímulos proapoptóticos. A capacidade do ABT-263 de matar células FL5.12-Bcl-2 ou FL5.12-Bcl-xL sob retirada de IL-3 foi significativamente atenuada na presença do inibidor de caspase ZVAD, indicando que a morte celular é dependente da caspase (Suplemento Fig. S2).

Para determinar se a citotoxicidade induzida pelo ABT-263 pode ser atribuída à ruptura das interações proteína-proteína da família Bcl-2 intracelular, foram feitos estudos de coimunoprecipitação. ABT-263 induziu uma diminuição das interações Bim:Bcl-xL dose-dependente em 2 horas após o tratamento em células FL5.12-Bcl-xL (Fig. Suplementar S3). Também foram observados padrões similares para a ruptura dos complexos Bim:Bcl-2 nas células FL5.12-Bcl-2 (dados não mostrados), indicando que o ABT-263 restaura a morte celular dependente de IL-3 atenuando a capacidade de Bcl-xL e Bcl-2 de sequestrar fatores pró-apoptóticos como o Bim. A capacidade da ABT-263 de interromper as interações proteína-proteína da família Bcl-2 foi confirmada em um sistema bi-híbrido de mamíferos (Fig. 2B). ABT-263 inibiu a interação do VP16-Bcl-xS com Gal4-Bcl-xL (aparente EC50 ∼50 nmol/L), enquanto o enantiômero foi muito menos eficaz.

Para melhor interrogar o mecanismo de ação, a atividade do ABT-263 foi avaliada em uma série de células de fibroblasto embrionário de camundongo (MEF) que incluía células do tipo selvagem (WT), bem como células deficientes em Bcl-x, Mcl-1, e Bax/Bak (DKO). ABT-263 morte celular potentemente induzida em Mcl-1-/- (EC50 ∼50 nmol/L) mas não em Bcl-x-/- (EC50 ≥10 μmol/L) Células MEF (Suplemento Fig. S4A). Isso confirma a capacidade do ABT-263 de inibir funcionalmente o Bcl-xL, mas não o Mcl-1, em um contexto celular e é consistente com observações anteriores com ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). O enantiômero foi ineficaz em ambos os sistemas. O ABT-263 também foi ineficaz (EC50 ≥10 μmol/L) em matar células WT ou DKO MEF, consistente com os relatórios anteriores (14). Em contraste, o etoposido, um agente citotóxico geral, assim como dois mimetistas BH3 de pequena molécula, induziram a morte celular com EC50s similares em todos os quatro tipos de células MEF, sugerindo que estes compostos induzem a morte celular, pelo menos em parte, por mecanismos independentes da família Bcl-2 (Fig. Complementar. S4C).

Para avaliar a capacidade do ABT-263 de induzir apoptose diretamente em uma linha de células tumorais humanas, a translocação de Bax e a liberação de citocromo c foram monitoradas na linha de células SCLC H146. H146 demonstrou ser dependente de Bcl-2 para sobrevivência (25). ABT-263 induziu uma diminuição dose-dependente na citosólica Bax associada a um aumento no citocromo citosólico dentro de 2 horas após o tratamento (Fig. 2C-i). O enantiômero foi incapaz de desencadear uma resposta similar. A ativação do bax e a liberação do citocromo c foram confirmadas por microscopia (Fig. 2C-ii). O anticorpo anti-Bax 6A7, que reconhece especificamente a forma conformavelmente ativa do Bax, foi usado para detectar o Bax ativado em células H146. Consistente com os estudos de fracionamento, o tratamento com ABT-263 foi associado a um aumento substancial de Bax ativado. Isto correspondeu à liberação de citocromo c da mitocôndria para o citosol como evidenciado pela diminuição das estruturas puntiformes e aumento da coloração citosólica. O ABT-263, mas não o seu enantiômero, também induziu um aumento dependente do tempo na atividade da caspase-3 que foi detectável às 2 horas e que atingiu o seu pico em ∼6 horas (Fig. 2D). Este efeito foi dependente da concentração, com um EC50 ∼100 nmol/L no ponto de tempo de 6 horas (Fig. 2D, inset). Em contraste, a camptotecina, um inibidor da topoisomerase I relatado para induzir apoptose mitocondrial e subsequente ativação da caspase (27, 28), só foi capaz de provocar um aumento na atividade da caspase-3 após 24 horas (dados não mostrados). Estes dados indicam que o ABT-263 age diretamente para inibir o Bcl-2 e Bcl-xL, liberando fatores pró-apoptóticos como o Bim para induzir uma rápida ativação da via apoptótica mitocondrial.

Para avaliar a amplitude da atividade celular do ABT-263, foi examinado um painel de linhas de células tumorais humanas abrangendo uma gama de tipos tumorais. Consistente com relatos anteriores sobre ABT-737 (12), o ABT-263 exibiu atividade monoagente em SCLC e malignidades hematológicas, mas não na maioria dos outros tipos de tumor (dados não mostrados). Para investigar mais de perto a atividade dentro destes tipos de tumor sensíveis, o ABT-263 foi examinado em painéis de linhas celulares derivadas de SCLC (n = 22) e malignidades hematológicas (n = 23). Em cada painel, o ABT-263 exibiu uma faixa de potência com 32% (SCLC) e 48% (hematológicos) das linhas celulares sendo altamente sensíveis (EC50 <1 μmol/L; Fig. 3). O enantiômero foi >20 vezes menos ativo nestas células sensíveis (Tabela Complementar S2).

Dose oral de ABT-263 resulta na regressão de SCLC e TODOS os tumores de xenograft in vivo. Para ampliar estas observações in vivo, o ABT-263 foi avaliado em modelos de xenoenxerto de flanco estabelecidos a partir de algumas das linhas sensíveis de SCLC e células hematológicas. Quando dosado p.o., uma vez por dia a 100 mg/kg durante 21 dias consecutivos, o ABT-263 induziu respostas tumorais rápidas e completas (CR) que foram duráveis por várias semanas após o final do tratamento em todos os animais portadores de tumores H889 (SCLC) ou RS4;11 (TODOS) (Fig. 4A). Tratamento similar de ratos portadores de tumores H146 SCLC induziu regressões rápidas resultando em RC em 60% e PR em 40% dos animais (Fig. 4A). Neste modelo foi observada uma regressão tumoral gradual a partir de várias semanas após o final da dosagem. A atividade foi dependente da dose no modelo de xenoenxerto H146. O tratamento com ABT-263 a 50 mg/kg durante 21 dias consecutivos induziu RC em 22% e RP em 44% dos animais, enquanto 25 mg/kg induziu uma inibição estatisticamente significativa, mas modesta, do crescimento tumoral sem regressões tumorais observadas. O ABT-263 foi bem tolerado (<5% de perda de peso) em todas as doses.

Para correlacionar a exposição do ABT-263 com a eficácia antitumoral, foi feito um estudo farmacocinético em estado estável no qual ratos não portadores de tumores foram dosados p.o. uma vez por dia durante 3 dias, e as concentrações de fármacos plasmáticos determinadas após a terceira dose. Tanto o pico de concentração plasmática (Cmax) como a área sob a curva de concentração plasmática (AUC) foram proporcionais à dose e aumentaram de forma aproximadamente linear (Tabela Suplementar S3). Uma dose de 100 mg/kg, que produziu uma taxa de resposta global de 100% (taxa de resposta global = CR + PR), deu valores de Cmax e AUC de 7,7 μmol/L e 90 μmol/L h, respectivamente. A exposição resultante de uma dose de 50 mg/kg, que produziu uma taxa de resposta global de 66%, foi de 5,4 μmol/L (Cmax) e 54 μmol/L h (AUC). Esses dados indicam que os picos de concentração plasmática de ABT-263 variando de ∼5.4 a 7.7 μmol/L são altamente eficazes.

ABT-263 aumenta a atividade dos agentes quimioterápicos in vivo. A eficácia in vivo do ABT-263 foi investigada em combinação com agentes terapêuticos comumente utilizados em diversos modelos agressivos de malignidades hematológicas. ABT-263 e rituximab foram examinados no modelo do DoHH2 linfoma de células B do xenoenxerto de flanco (Fig. 4B). Quando dosado diariamente a 100 mg/kg p.o. por 17 dias, o ABT-263 exibiu 44% de inibição do crescimento tumoral. Uma única dose de 10 mg/kg de rituximab eliciou 84% de inibição do crescimento tumoral. Nem o ABT-263 nem o rituximab sozinho alcançaram regressão tumoral sustentada; entretanto, a combinação exibiu um efeito superior, alcançando 70% de RC e 10% de PR. Esta combinação também resultou em uma melhora significativa no atraso no crescimento tumoral (>700%) versus rituximab sozinho (300%).

A eficácia do ABT-263 sozinho e em combinação com um regime R-CHOP modificado também foi avaliada em um modelo GRANTA-519 de xenoenxerto de flanco de linfoma de células mantélicas (Fig. 4B). O ABT-263 foi administrado a 100 mg/kg p.o. por 21 dias consecutivos, o que provocou 40% de inibição do crescimento tumoral. Em comparação, o regime R-CHOP inibiu o crescimento tumoral em 68% com 20% de RC. A combinação resultou em regressões tumorais dramáticas e respostas tumorais completas em todos os animais testados sem evidência de crescimento tumoral em quatro dos nove tumores avaliados.

Finalmente, examinamos a capacidade do ABT-263 de potencializar os efeitos da quimioterapia em um modelo resistente ao ABT-263. No modelo de xenoenxerto de flanco OPM-2 de mieloma múltiplo (in vitro EC50 = 6,7 μmol/L), o ABT-263 administrado diariamente durante 21 dias a 100 mg/kg não inibiu significativamente o crescimento do tumor (Fig. 4B). O bortezomibe administrado na sua dose máxima tolerada (1 mg/kg i.v., qd ×3) inibiu o crescimento tumoral em 70% sem CRs. ABT-263 aumentou a eficácia do bortezomib com a combinação resultando em 95% de inibição do crescimento tumoral e uma taxa de CR de 40%.

ABT-263 induz uma trombocitopenia rápida mas reversível. Recentemente relatamos que ABT-737 induz uma trombocitopenia rápida e reversível em animais resultante da inibição das proteínas da família Bcl-2 e indução de apoptose em plaquetas circulantes sem toxicidade da medula óssea (29). Como esperado, o ABT-263 também induz a trombocitopenia. Após uma única dose p.o. em cães, a contagem de plaquetas circulantes diminuiu em 2 horas com um nadir plaquetário às 6 horas e evidência de ressalto em 24 horas (Fig. 5A). Para determinar os efeitos da dosagem prolongada, examinamos a relação farmacocinética/farmacodinâmica após múltiplas doses diárias em cães (Fig. 5B). ABT-263 foi dosado p.o. a 2 mg/kg/d por 6 dias, e depois aumentado para 6 mg/kg/d por mais 6 dias. A contagem de plaquetas e as concentrações de drogas plasmáticas foram avaliadas 6 horas após o tratamento para capturar os prováveis nadirs plaquetários nos dias 1 a 4 e nos dias 7 a 11. Com 2 mg/kg, a contagem de plaquetas diminuiu de um valor inicial de ∼250,000/μL para ∼125,000/μL até a segunda dose, mantendo-se depois estável para as doses restantes. A concentração do fármaco plasmático obtido 6 horas após o tratamento (C6h) permaneceu constante em valores que variam de 3,6 a 4,2 μmol/L. Com base no perfil farmacocinético do ABT-263 (Fig. S1 suplementar), o C6h é aproximadamente 2 vezes menor que o Cmax, indicando que o pico de concentração plasmática obtido após múltiplas doses de 2 mg/kg é de ∼7 a 8 μmol/L. Estes níveis são semelhantes aos obtidos após uma dose de 100 mg/kg de dose p.o. em ratos. Quando a dose de ABT-263 foi aumentada para 6 mg/kg/d, a contagem de plaquetas diminuiu para ∼50,000/μL até o segundo dia desta dose mais alta e permaneceu relativamente constante durante a duração do estudo. Os valores de C6h nesta dose variaram de 10,2 a 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). O ABT-263 foi bem tolerado neste estudo, sem mortalidade ou sinais clínicos adversos. No entanto, alguns hematomas foram aparentes no local da punção venosa, consistentes com alterações na hemostasia. Estes dados indicam que a exposição diária repetida do ABT-263 em níveis comprovadamente altamente eficazes em modelos murinos resulta em uma redução de 4% em plaquetas circulantes em cães em ∼50. Além disso, concentrações plasmáticas várias vezes maiores que o nível eficaz são bem toleradas, com contagem de plaquetas circulantes reduzida para ∼50,000/μL.