Sumário
A ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose é uma técnica poderosa para fracionar macromoléculas como DNA, RNA e proteínas. Para este propósito, uma amostra contendo uma mistura de macromoléculas de tamanhos diferentes é estratificada na superfície de um gradiente cuja densidade aumenta linearmente de cima para baixo. Durante a centrifugação, macromoléculas de diferentes tamanhos sedimentam através do gradiente em diferentes taxas. A taxa de sedimentação depende, além da força centrífuga, do tamanho, forma e densidade das macromoléculas, assim como da densidade e viscosidade do gradiente. Desta forma, as macromoléculas são separadas por tamanho, com as maiores sedimentando-se em direção ao fundo e as mais leves permanecendo próximas ao topo do gradiente. O método tem sido particularmente bem sucedido no fracionamento do tamanho de moléculas grandes de DNA e tem sido amplamente utilizado para medir a indução e reparo de quebras de DNA após exposição a fatores clastogênicos. Aqui, descrevemos uma adaptação deste método que pode ser usada na análise do DNA recém-sintetizado formado durante a replicação do DNA. Através da análise do tamanho do ADN nascente em gradientes alcalinos de sacarose, as variações na actividade de replicação podem ser medidas após a exposição das células a agentes nocivos para o ADN. O método é particularmente útil, pois permite distinguir entre os efeitos de danos de DNA no alongamento da cadeia vs. iniciação de réplicas, o que é essencial para uma análise profunda do ponto de verificação intra-fásico. Esta capacidade torna a técnica única e justifica a sua natureza algo intensiva em trabalho.