Durante o processo de cicatrização após a fratura óssea, o calo mole forma-se adjacente ao local da fratura, é substituído pelo calo duro e é finalmente remodelado para a configuração óssea original. Embora a camada de câmbio do periósteo seja relatada como desempenhando um papel essencial na formação do calo, ainda nos falta evidência direta in vivo disso. Para investigar a linhagem celular do calo mole, analisamos o processo de cicatrização da fratura em Prx1-Cre;Repórter ROSA26 (R26R), Col1a1(3,6 kb)-Cre;R26R, Col1a1(2,3 kb)-Cre;R26R, Sox9-CreERT2;R26R e Sox9-LacZ com coloração X-gal. No Prx1-Cre;R26R, no qual as células do periósteo coradas para X-gal antes da fratura, todas as células do calo mole eram X-gal positivas, enquanto no Col1a1(3,6 kb)-Cre;R26R ratos, as células do periósteo antes da fratura coradas para X-gal e o calo mole era parcialmente composto de células X-gal positivas. Em contraste, nos ratos Col1a1(2,3 kb)-Cre;R26R, nos quais os osteoblastos maduros na camada de câmbio do periósteo foram marcados antes da fratura, nenhuma célula do calo mole no local da fratura era X-gal positiva. Esses resultados sugerem que a maioria das células do calo mole é derivada dos progenitores mesenquimais do periósteo, e não das células osteoblásticas maduras. Curiosamente, nos camundongos Sox9-LacZ, células X-gal positivas surgiram no periósteo adjacente ao local da fratura 3 dias após a fratura. Demonstramos isto injetando tamoxifen nos ratos Sox9-CreERT2;R26R durante 3 dias após a fratura, de modo que estas células periosteais Sox9-expressoras deram origem a células nos calos macios e duros. Nossos achados mostram que as células periosteais nas quais a expressão de Sox9 é induzida logo após a fratura são a principal fonte dos condrócitos e osteoblastos no calo da fratura.