Princípios de Montagem Aprendidos em Estudos In Vitro
Subunidade Ribosomal 30S e 50S de bactérias funcionais podem ser reconstituídas in vitro a partir do rRNA mais cada uma das proteínas ribossómicas. Estudos detalhados dos princípios bioquímicos e biofísicos subjacentes à montagem de ribossomas in vitro forneceram paradigmas úteis para orientar investigações da biogénese do ribossoma in vivo.
Um dos primeiros princípios revelados por estas experiências é que a montagem de r-proteínas em subunidades ribossómicas ocorre de uma forma hierárquica. Estudos de reconstituição de subunidades bacterianas de 30S ribossomal definiram um ‘mapa de montagem’ para a ordem de associação de cada r-proteína com o rRNA. Com base na sua ordem na hierarquia de ligação, as r-proteínas são designadas como primárias (ligação directa ao rRNA), secundárias (ligação dependente de proteínas de ligação primária), ou terciárias (ligação dependente de proteínas de ligação secundária). Embora tal mapa de dependência tenha provado ser um ponto de partida muito útil, ele não fornece nenhuma informação sobre a cinética da ligação de proteínas. Pelo contrário, o caminho de montagem pode refletir em grande parte a ordem em que cada proteína r está associada de forma mais estável com o rRNA. Além disso, o mapa de montagem não leva em conta nem a via dobrável de 16S rRNA independente das r-proteínas nem o papel na montagem do ribossomo do processamento nucleolítico dos precursores de rRNA que ocorre in vivo. Mais recentemente, estes aspectos da montagem da subunidade 30S foram explorados em maior detalhe usando técnicas como a sondagem química e radical hidroxila da conformação do RNA para testar mudanças na conformação do rRNP com o tempo, e a espectrometria de pulsação/espectrometria de massa (PC/MS) para determinar a cinética da ligação da proteína r ao rRNA.
Uma explicação possível para a observação de r-proteínas de ligação primária no mapa de montagem é que seus locais de ligação são criados pelo menos em parte pela conformação adotada por 16S rRNA independente de r-proteínas. De facto, de acordo com esta ideia e a visão de que os ribossomas evoluíram a partir de um catalisador RNA, foi demonstrado que o domínio de 5′ do 16S rRNA pode dobrar e formar contactos terciários na ausência de todas as r-proteínas. Esta estrutura terciária presumivelmente não é completamente estável na ausência de contatos protéicos e, portanto, é muito provavelmente estabilizada pela ligação de r-proteínas a locais que são criados por conformações transitórias adotadas pelo rRNA à medida que ele é dobrado. Portanto, o segundo princípio sugere que a dobragem do rRNA fornece a base da ligação da proteína r durante a montagem do ribossomo.
Um terceiro princípio que surgiu de estudos in vitro de ribossomos bacterianos é que o fortalecimento da ligação da proteína r com o rRNA ocorre à medida que a montagem do ribossomo progride. Muitas r-proteínas entram em contacto com múltiplos nucleótidos no rRNA. A pegada de radicais hidroxila resolvida no tempo revelou que alguns destes nucleótidos estão protegidos antes de outros, sugerindo que à medida que a biogénese dos ribossomas avança, as r-proteínas fazem mais contacto com o rRNA, tornando-se assim mais estáveis na integração com os ribossomas.
O estabelecimento inicial de alguns contactos entre r-proteínas e rRNA estabiliza potencialmente certas conformações de RNA, e induz alterações na conformação do rRNA para proporcionar locais de ligação a r-proteínas adicionais (secundárias ou terciárias). Portanto, a ligação de r-proteína consolida os ganhos de dobramento do RNA e confere direcionalidade ao processo de montagem. Isto sugere um modelo onde a montagem prossegue através de uma série alternada de mudanças conformacionais de RNA e ligação de proteínas, que estabilizam sequencialmente a estrutura final do RNA. Dados cinéticos revelaram que a montagem de subunidades maduras de 30S ocorre através de múltiplas vias dobráveis paralelas de RNA, todas convergindo para o produto final. Isto levou ao conceito de uma paisagem de montagem em oposição a uma via única sobre a qual ocorre a montagem de subunidades ribossómicas.
Finalmente, estudos in vitro revelaram que a montagem do ribossoma ocorre na direcção de 5′ a 3′. PC/MS e a sondagem química da estrutura secundária do rRNA mostraram que a ligação da proteína r ao domínio de 5′ do rRNA pode ser observada antes de serem estabelecidos contactos de proteínas com o domínio de 3′ do rRNA. Em contraste, os ensaios de pegada de radicais hidroxila mostraram uma explosão inicial de proteção de nucleotídeos ao longo de 16S rRNA indicando que os núcleos dobráveis de RNA de muitos locais diferentes espalhados pelo RNA, e assim apontando para uma falta de direcionalidade de 5′ a 3′ na montagem. Estas observações conflitantes podem ser conciliadas levando em conta a natureza das diferentes configurações experimentais. PC/MS mede a cinética da ligação da proteína ao rRNA, e como tal apenas interacções estáveis de r-proteína-rRNA podem ser detectadas porque as r-proteínas que se ligam fracamente durante o pulso podem ser lavadas durante a perseguição. Os ensaios de pegada, por outro lado, podem capturar a proteção dos nucleotídeos tanto por r-proteínas de interação fraca quanto por r-proteínas associadas de forma estável. Em conjunto, estes dados indicam que enquanto a montagem dos ribossomas pode se nuclear através de todo o rRNA, a associação final estreita das r-proteínas com o rRNA ocorre numa direcção de 5′ a 3′.
É importante considerar como estas experiências in vitro podem ou não reflectir a montagem in vivo. Por exemplo, quando a montagem do ribossomo ocorre in vivo, ele é acoplado com a transcrição do rRNA, o que também contribui presumivelmente para a direcionalidade observada de 5′ a 3′ de associação de r-proteína. rRNA pode ter evoluído para dobrar de 5′ a 3′ como é sintetizado, e incorporar r-proteínas assim, acoplando assim a montagem com a transcrição do rRNA. Além disso, a exigência de uma etapa de aquecimento durante a reconstituição das subunidades ribossômicas in vitro e a identificação de um número de mutantes bacterianos defeituosos na produção de ribossomos indicam a necessidade de fatores de trans-ação durante a biogênese do ribossomo in vivo.