Biossíntese de trans 4-hidroxiprolina por cepas recombinantes de Corynebacterium glutamicum e Escherichia coli

Construção de cepas recombinantes produtoras de trans-Hyp

Existem vários genes sendo especulados como suposto gene L-prolina 4-hidroxilase na base de dados, incluindo genes em Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 e Dactylosporangium. sp. Usando PCR, clonamos e obtivemos os genes putativos de P4H de P. stutzer e B. bronchiseptica RB50, chamados p4hP e p4hB. Eles foram ligados aos plasmídeos correspondentes após a digestão e convertidos em C. glutamicum e E. coli, respectivamente. O comprimento de p4hP foi de 918 bps enquanto que p4hB foi de 924 bps. Estas sequências foram 100% idênticas aos genes reportados no NCBI. O gene do trans-P4H da Dactylosporangium sp. (p4hD) foi expresso em E. coli com sucesso e pode transformar a linha L com boas propriedades enzimáticas . O comprimento da p4hD era de 816 bps codificando um polipéptido 272-amino-ácido com o peso molecular de 29.715 daltons . Neste estudo, o p4hD foi aplicado com algumas modificações sobre as bases nucleares. A seqüência gênica original do p4hD foi analisada (http://www.kazusa.or.jp/codon/) e os resultados mostraram que havia alguns códons raros tanto para C. glutamicum quanto para E. coli. Foi relatado que os códons raros estão fortemente associados com baixo nível de expressão de proteínas . A otimização dos códons para expressão heteróloga de proteínas tem mostrado frequentemente aumentar drasticamente a expressão protéica . Assim, os códons raros do gene p4hD foram substituídos por aqueles utilizados com alta freqüência em C. glutamicum e o conteúdo de GC foi ajustado de 73% para 61% através de conversão sinônima, que foi próxima à do C. glutamicum. O gene modificado do p4hD foi sintetizado de acordo com as modificações acima (arquivo adicional 1).

A expressão do P4H é um dos aspectos importantes na construção da via biossintética trans-Hyp. A Figura 2 mostra a SDS-PAGE de trans-P4Hs expressa em C. glutamicum recombinante e E. coli. Todas as trans-P4Hs recombinantes foram expressas como proteínas solúveis sem corpos de inclusão. Foi obviamente que as trans-P4Hs recombinantes em E. coli foram expressas muito mais que as em C. glutamicum (Figura 2). Muitos factores têm influência na expressão de proteínas estranhas, incluindo promotores, o sistema hospedeiro-vector e condições culturais, etc. . Como foi o primeiro a expressar trans -P4Hs em C. glutamicum, estudos mais abrangentes como seleção de promotores e otimização das condições culturais serão considerados em nosso trabalho futuro.

Comparação das atividades de P4H

Oxygenases são amplamente aplicadas na indústria, pois podem catalisar a oxifuncionalização altamente específica das ligações C-H não ativadas sob condições leves, especialmente a transferência de oxigênio molecular para um substrato . P4H pertence a uma família de dioxigenase dependente de 2-oxoácidos, que é uma proteína monomérica e utiliza os substratos monoméricos em vez de poliméricos . As atividades das trans-P4Hs utilizando células inteiras recombinantes neste estudo foram medidas (Tabela 1). Nossos dados indicaram que o nível de proteína expresso e a atividade enzimática foi maior a 30°C. Os resultados também mostraram que os plasmídeos eram muito estáveis, pois as estabilidades plasmídicas das cepas recombinantes de E. coli e C. glutamicum eram todas superiores a 98% no final da fermentação.

As células recombinantes com expressão de diferentes genes mostraram diferentes níveis de atividades catalíticas em direção à linha L. A atividade de trans-P4H expressa por E. coli BL21/ pET28a-p4hD foi a mais alta entre todas as cepas recombinantes construídas. Os novos genes clonados e expressos de P. stutzeri e B. bronchiseptica também mostraram atividades interessadas. Quanto às diferentes cepas hospedeiras, a E. coli representou melhor que o C. glutamicum, o que pode estar relacionado com o desempenho do plasmídeo correspondente. Quatro linhagens de C. glutamicum produtoras de L. glutamicum foram usadas como estirpes hospedeiras de expressão e as linhagens recombinantes resultantes mostraram diferentes atividades enzimáticas. A maior atividade enzimática específica entre as cepas de C. glutamicum foi de 40,7 U/mg – célula úmida por C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Entretanto, a atividade enzimática específica do recombinante E. coli/pET28a -p4hD foi de até 60,4 U/mg – célula úmida. O crescimento de três cepas recombinantes de E. coli foi semelhante. Mas houve diferença significativa entre as cepas recombinantes de C. glutamicum. As cepas recombinantes de C. glutamicum com maior atividade enzimática específica cresceram menos do que aquelas com menor atividade enzimática específica. Adicionalmente, a atividade enzimática da E. coli BL21 /pET28a -p4hD foi semelhante à da E. coli W1485/pWFH1 e superior à da E. coli BL21/pET24-p4h1 de . A p4hD na E. coli W1485/pWFH1 foi a original na Dactylosporangium sp., enquanto a p4hD na E. coli BL21/pET24-p4h1 foi modificada. Embora a otimização do códon neste estudo tenha sido projetada para C. glutamicum, os resultados indicaram que ela também foi bem sucedida em E. coli.

Produção de trans-Hyp em frascos

A produção de trans-Hyp por diferentes cepas recombinantes de C. glutamicum e E. coli também foi mostrada na Tabela 1. A produção de trans-Hyp por estas cepas recombinantes dependeu tanto da atividade enzimática de P4H como do crescimento celular. A E. coli BL21/ pET28a-p4hD teve a maior produção, que coincidiu com a sua atividade enzimática específica. Embora as cepas recombinantes de E. coli tenham crescido de forma semelhante no meio de produção, houve diferença significativa na produção de trans-Hyp que não manteve o mesmo nível com as atividades enzimáticas específicas. A produção de trans-Hyp por cepas recombinantes de C. glutamicum também foi muito inferior à de E. coli BL21/pET28a-p4hD. Isso se deve tanto à menor expressão de trans-P4H como ao menor crescimento celular em C. glutamicum. A produção de quatro linhagens de C. glutamicum em L foi também inferior a 1 g/L. Houve pouca diferença de produção de trans-Hyp entre as cepas recombinantes de C. glutamicum com o mesmo gene p4hD, apesar de algumas cepas terem melhor desempenho enzimático e produção de prolina.

Usar as cepas recombinantes para sintetizar diretamente trans-Hyp a partir da glicose via fermentação foi conseguido uma vez que tanto as enzimas como os precursores necessários no processo estavam disponíveis. As trans-P4Hs estranhas sobre expressas catalisaram a hidroxilação da linha L na posição trans-4, enquanto o 2- cetoglutarato foi fornecido pela glicose através do ciclo TCA e depois oxidativamente descarboxilado para succinato (Figura 1). Foi relatado que a prolina foi demandada na produção de Hyp por E. coli recombinante apenas com o gene p4h. O carbono em prolina adicionado durante a fermentação só fluiu em aminoácidos sintetizados a partir de intermediários do ciclo TCA e não em gluconeogênese. No entanto, a Hip acumulada estava em um nível relativamente alto mesmo sem a adição de prolina neste estudo. Podia-se entender que Corynebacterium tinha o poderoso caminho biossintético da prolina . A via biossintética da prolina também foi identificada na E. coli, que pode contribuir para a síntese de trans Hyp por meio de cepas recombinantes de E. coli. A modificação da via da prolina em E. coli aumentou o rendimento de Hyp, enquanto a formação de Hyp também pode aliviar a inibição do feedback da prolina . A quantidade de prolina (0-4 mM) promoveu a produção de trans-Hyp. Entretanto, a adição contínua de L-prolina não melhorou significativamente o rendimento da produção (Tabela 2). Neste estudo, o tempo de cultivo foi significativamente menor do que os relatados nas literaturas, o que poderia atribuir aos diferentes meios utilizados e também indicou que havia um grande potencial com otimização. De fato, 2,28 g/L de trans-Hyp foi produzido por E. coli recombinante sem adição de L-proline em frascos com uma pequena modificação do meio e 6,72 g/L foi obtido por suplemento de apenas 4 mM de L-proline.

Para aumentar ainda mais a biossíntese de trans-Hyp por C. glutamicum recombinante e E. coli, abordagens alternativas também devem ser consideradas. Na E. coli, a degradação da prolina deve ser superada. Embora a produção de trans-Hyp por um mutante putA de E. coli não tenha sido melhorada, o rendimento baseado na prolina utilizada foi muito aumentado. Tanto em C. glutamicum quanto em E. coli, a expressão de P4H recombinante como uma das oxigenases está envolvida no metabolismo fisiológico das células hospedeiras, incluindo o co-fator, co-substrato e oxigênio. Além disso, sem uma poderosa via sintética de prolina na E. coli, a disponibilidade e transporte do substrato limitará seriamente a transformação.