Dois resíduos de aminoácidos determinam a sensibilidade 2-APB dos canais iônicos TRPV3 e TRPV4

Resultados

Identificação de Mutações que Afetam Especificamente as Respostas 2-APB.

Programamos uma biblioteca de mutantes TRPV3 do mouse que consiste em ≈14,000 construções de cDNA que carregam em média 2,5 mutações por clone geradas por PCR com tendência a erro. As construções mutantes foram transformadas em células de rim embrionárias humanas (HEK293), e as respostas de cálcio evocadas pelo calor (42 °C), 25 μM 2-APB, e 1,75 mM de cânfora foram monitoradas em um leitor de placa de imagem fluorescente (FLIPR). Recentemente, descrevemos a identificação dos resíduos especificamente necessários para a ativação do calor do TRPV3 (20). Aqui, focamos no conjunto de dados 2-APB e cânfora para identificar resíduos especificamente necessários para as respostas químicas.

Específico, selecionamos clones que mostraram respostas normais para uma química, mas reduziram significativamente a ativação pela outra (para critérios de seleção, ver Métodos). Clones positivos foram coletados, regravados e curvas de dose-resposta total contra cada estímulo foram medidas, e os valores de EC50 foram calculados (ver Métodos). Sete clones mutantes foram confirmados como especificamente 2-APB deficientes, e sequenciados. Notavelmente, todos os 7 clones incluíram mutações em 1 de 2 resíduos. O primeiro, a histidina (H) 426, está presente na região terminal N citoplasmática, entre os domínios da anquirina e transmembrana. Identificamos 4 substituições distintas de H426 na tela (Tabela 1). A segunda, arginina (R) 696, está presente dentro da caixa C-terminal do PTRT (IWRLQR), um domínio conservado nos canais do PTR (2, 3). As 3 mutações neste resíduo têm a mesma relação estreita entre a arginina e a lisina para substituição. Todas as 7 mutações causaram graves déficits nas respostas de 2-APB, sem afetar as respostas de cânfora (Tabela 1). Embora alguns clones deficientes em cânfora também tenham sido identificados, foram mutações relativamente mais sutis, mudando os valores de EC50 de cânfora ≈2 – dobrado ou menos (dados não mostrados). Por esta razão, focalizamos este estudo nos 2 resíduos causando especificamente >10 vezes 2-APB deficiência.

Caracterização Electrofisiológica Inicial dos Canais TRPV3-H426 e TRPV3-R696.

FLIPR é uma forma indirecta de medir a actividade do canal iónico. Para confirmar nossos resultados FLIPR, utilizamos a técnica de patch clamp e medimos as correntes de células inteiras do rato tipo selvagem TRPV3, TRPV3-H426N e TRPV3-R696K quando 2-APB (1 μM a 3 mM) ou cânfora (0,3 a 20 mM) foram aplicados individualmente, de baixas a altas concentrações (Fig. 1 e Fig. S1). De forma dependente da concentração, correntes ativadas de 2-APB em células HEK293 transfectadas com TRPV3 do tipo selvagem com valores médios EC50 de 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) e 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) a +100 e -100 mV, respectivamente (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB não induziu correntes mensuráveis em células HEK293 transfectadas com TRPV3-H426N até 100 μM. Entretanto, concentrações de 2-APB que estão saturando para TRPV3 do tipo selvagem (0,3 a 3 mM) foram capazes de ativar correntes neste mutante de forma dependente da concentração (Fig. 1A; Fig. S1A). Consequentemente, a TRPV3-H426N mostrou um deslocamento EC50 >10 vezes de ativação dependente de 2-APB, e a resposta nunca atingiu saturação. Em experimentos paralelos, a cânfora também ativou correntes em células HEK293 transfectadas com TRPV3 do tipo selvagem de forma dependente de concentração com valores de EC50 de 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) e 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) a +100 e -100 mV, respectivamente. Importante, respostas do tipo selvagem à cânfora foram observadas em células HEK293 transfectadas com o TRPV3-H426N , confirmando que a ativação da cânfora é inalterada neste mutante (Fig. 1A; Fig. S1B).

Em experimentos com patch-clamp de células inteiras, o 2-APB também induziu uma ativação mínima do TRPV3-R696K. A +100 mV, o 2-APB começou a ativar células HEK293 expressando este canal mutante em ≈3 μM, e atingiu saturação em 30 μM, com um EC50 de 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Concentrações mais elevadas de 2-APB (>30 μM) evocaram uma corrente dessensibilizadora com uma “off-response” após a lavagem do 2-APB, um fenómeno que é descrito em detalhe abaixo. Entretanto, a -100 mV, o 2-APB não ativou os canais mutantes R696K mesmo a 1 mM (Fig. 1B; Fig. S1A). A resposta máxima de 2-APB a 1 mM a -100 mV foi de -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), que é significativamente menor (>10 vezes) do que para canais do tipo selvagem TRPV3 (-482,1 ± 69,2 pA/pF a 300 μM, n = 17), sugerindo que a resposta máxima do canal evocado pelo 2-APB é diminuída no mutante TRPV3-R696K. Entretanto, a cânfora ativa respostas similares às células TRPV3 e TRPV3-R696K-transferidas pelo HEK293 (Fig. 1B; Fig. S1B). Portanto, os dados eletrofisiológicos iniciais confirmaram nossos resultados de triagem que os mutantes TRPV3-H426N e TRPV3-R696K são deficientes na resposta do 2-APB, sem afetar a função geral do canal, conforme testado por sua capacidade de responder à cânfora.

Em seguida perguntamos quais propriedades da cadeia lateral dos mutantes H426 e R696K são cruciais para a ativação do TRPV3 pelo 2-APB. Nós individualmente mutamos as posições 426 e 696 para todos os outros aminoácidos e medimos as curvas de dose-resposta FLIPR tanto para 2-APB quanto para a cânfora. Curiosamente, todos os mutantes H426 tinham diminuído as respostas de 2-APB com um forte (>10 vezes) aumento dos valores de EC50 (Tabela S1). A maioria dos mutantes teve respostas normais de cânfora, com exceção da substituição da hélice por pró-linha, que mostrou um aumento de EC50 de cânfora em ≈2. Os dados são consistentes com o resultado da nossa tela primária que identificou 4 substituições diferentes resultando em deficiência de 2-APB nesta posição. Os canais mutantes portadores de cadeias laterais F, T e W aromáticas não responderam nem à cânfora nem ao 2-APB. Entretanto, a maioria dos mutantes R696 mostrou respostas reduzidas de 2-APB, mas também teve respostas reduzidas de cânfora máxima (20 mM), indicando que essas mutações afetam a expressão ou função geral do canal (Tabela S2). Este resultado também é consistente com o nosso resultado inicial da tela primária, onde apenas a substituição da lisina foi identificada para ser especificamente necessária para 2-APB neste resíduo. O R696F também mostrou algum déficit específico de 2-APB, embora as respostas máximas de cânfora tenham sido ligeiramente afetadas. Mutantes R696D, R696G, R696N, R696P, R696S e R696T não mostraram respostas significativas para 2-APB ou cânfora quando comparados com células pcDNA transmitidas por vetores.

Resposta dependente de tensão Permaneceu intacta em Mutantes 2-APB.

Dependência de tensão mostrou ter papéis importantes na ativação do canal TRP e na alimentação (1, 10-12, 21). Na ausência de estimuladores químicos (por exemplo cânfora ou 2-APB), os passos de tensão de -120 a +180 mV (passo 20 mV) não activaram correntes em células HEK293 transfectadas com TRPV3 do tipo selvagem, indicando que TRPV3 (ao contrário de TRPV1 e TRPM8) não é activado apenas por tensão na gama aqui testada (20, 22). Entretanto, na presença de 30 μM 2-APB, foi ativada uma corrente dependente de tensão (Fig. S2A). Como previsto, não foi observada nenhuma corrente modulada por tensão detectável no TRPV3-H426N quando tratado com 30 μM 2-APB (Fig. S2B). Entretanto, a cânfora de 6 mM evocou uma corrente dependente de tensão em células HEK293 expressando TRPV3 do tipo selvagem (V1/2 de 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A e D) e TRPV3-H426N (V1/2 de 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B e D). Semelhante ao TRPV3-H426N, não houve corrente modulada de tensão detectável no TRPV3-R696K quando tratado com 30 μM 2-APB (Fig. S2C). No entanto, a cânfora ativou uma corrente dependente de tensão com um V1/2 de 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C e D). Estes resultados indicam que a modulação-tensão está intacta no TRPV3-H426N e no TRPV3-R696K, e implica que a perda de tensão-dependência não é provavelmente a causa da diminuição das respostas ao 2-APB nestes canais mutantes.

Sensibilidade à temperatura do TRPV3-H426N e do TRPV3-R696K.

Sensibilidade à temperatura é uma marca da função do canal TRPV3 (14, 16, 23). Portanto, perguntamos se a ativação da temperatura foi alterada nos clones TRPV3-H426N e TRPV3-R696K. Medimos a activação da temperatura (25 a 42 °C) das células HEK293 transfectadas com TRPV3, TRPV3-H426N, ou TRPV3-R696K mutantes num ensaio FLIPR. As respostas ao calor do TRPV3-H426N foram iguais ou ligeiramente maiores que as respostas ao TRPV3 do tipo selvagem (n = 4 experimentos), sugerindo que a ativação por 2APB- e calor pode ser separada (Fig. S2E; e dados não mostrados). Entretanto, as respostas ao calor na TRPV3-R696K foram muito menores comparadas com as do tipo selvagem (n = 3 experimentos), sugerindo que este mutante não está alterando especificamente a ativação do 2-APB (Fig. S2E).

Dessensibilização dependente do cálcio da TRPV3-R696K.

Uma característica interessante da resposta 2-APB em células TRPV3-R696K transferidas do HEK293 é a dessensibilização rápida em >30 μM 2-APB e uma off-resposta a 2-APB em concentrações elevadas (Fig. S3). Este fenómeno está em contraste com o TRPV3 do tipo selvagem, que se sensibiliza em resposta à estimulação repetitiva/contínua de produtos químicos ou calor (14, 16). O mecanismo subjacente à sensibilização da TRPV3 é proposto para ser uma perda de inibição do cálcio deste canal (22). Como a dessensibilização da maioria dos outros canais de TRPV (como TRPV1 e TRPA1) a estímulos químicos ou de temperatura também depende do cálcio extracelular (24, 25), nós nos propomos a testar se o cálcio extracelular tem um papel nas respostas dessensibilizantes 2-APB-evoked no TRVP3-R696K. Surpreendentemente, na ausência de cálcio extracelular, 100 μM 2-APB ativou uma corrente interna e externa do tipo selvagem e robusta em TRPV3-R696K (densidade de corrente de TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF a +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF a -100 mV (n = 5); TRPV3 do tipo selvagem: 615,0 ± 266,7 pA/pF a +100 mV, e -471,0 ± 83,2 pA/pF a -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A e B). Este resultado sugere que a substituição de uma arginina por uma lisina na posição 696 na caixa do TRPV3 conduz o canal a um estado dessensibilizador no 2-APB mas não a uma estimulação de cânfora de forma dependente do cálcio. Um resíduo putativo Ca2+ ligante no domínio do laço de poros, o aspartato 641, é conservado entre todos os canais de TRPV e é crítico para as propriedades de permeação dos canais de TRPV (26, 27). A mutação de D641 em asparagina (N) demonstrou reduzir o bloco vermelho de ruténio e a inibição extracelular de cálcio de alta afinidade de TRPV3 e outros canais de TRPV (17, 22, 26, 27). Portanto, examinamos se a mutação D641N poderia aliviar o clone de TRPV3-R696K da perda dependente do cálcio da resposta de 2-APB. Em um ensaio FLIPR, o TRPV3-D641N teve um EC50 de 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), que é aproximadamente metade do valor do TRPV3 do tipo selvagem (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). A dupla mutação TRVP3-D641N/R696K teve um EC50 de 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), mostrando que a mutação D641N restaurou completamente a resposta 2-APB do TRPV3-R696K. Como esperado, a resposta da cânfora foi semelhante entre TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N e TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C e D). Estes estudos demonstram que a TRPV3-R696 não é puramente uma mutação de 2-APB. Os déficits observados são mediados pelo cálcio, afetando as respostas de 2-APB mas não a cânfora.

A Sensibilidade de 2-APB em Ortologs TRPV3.

As conservações de aminoácidos e variações entre ortologs são ferramentas úteis para dissecar as relações estrutura-função das proteínas, incluindo os canais de TRP (28, 29). Portanto, perguntamos se esses ortologs TRPV3 têm cânfora comparável e respostas de 2-APB. De fato, canais TRPV3 humanos, cães e sapos, que têm histidinas na posição equivalente a ratos 426 (Fig. 2A), têm respostas 2-APB similares quando superexpressas em células HEK293 (embora as respostas de cânfora em Xenopus tropicalis TRPV3 tenham diminuído em comparação com a TRPV3 de ratos do tipo selvagem) (Fig. 2C). Como esperado, quando H426 em humano, cão e sapo foi mutado em N, as curvas de concentração-resposta de 2-APB foram fortemente deslocadas para a direita em cada um destes ortologs de TRPV3 (Fig. 2B). Novamente, esta mutação não diminuiu a sensibilidade à cânfora quando comparada aos ortologs de TRPV3 do tipo selvagem (Fig. 2C). Pelo contrário, tanto os mutantes humanos quanto os sapos TRPV3 H426N tinham sensibilidade à cânfora ligeiramente maior do que os seus homólogos do tipo selvagem. Estes resultados indicam que o mecanismo de ativação 2-APB da TRPV3 pode ser conservado em diferentes espécies.

Interessantemente, embora R696 esteja conservado na caixa de TRPV3 entre todas as espécies, a posição equivalente ao rato 426 em TRPV3 de galinha (cTRPV3) é um N (427). Como mostrado acima, uma substituição de H-N por 426 resíduos em mamíferos ou espécies anfíbias interfere com as respostas adequadas de 2-APB (Fig. 2A). Consistente com este resíduo sendo importante para respostas de 2-APB, o EC50 de 2-APB em cTRPV3 é 146,8 ± 3,4 μM (nHill = 2,5) comparado com o de 11,5 ± 3,5 μM (nHill = 1,1) para a TRPV3 do rato. De forma impressionante, a migração de N427 para H deslocou a curva concentração-resposta de 2-APB significativamente para a esquerda (EC50 de 6,1 ± 0,9 μM, nHill = 2,3), enquanto que deixou o valor de EC50 para cânfora inalterado (Fig. 3A). O registro da pinça de fixação de células inteiras confirmou que a curva de concentração-resposta de 2-APB foi fortemente deslocada para a esquerda no TRPV3-N427H da galinha em comparação com o cTRPV3 do tipo selvagem em ambos +100 e -100 mV (Fig. 3B). Os registros de canal único revelaram quase 200 vezes mais aberturas de canal sobre o nível basal em 25 μM 2-APB em manchas de cTRPV3-N427H de células de compressão cTRPV3-N427H (n = 7), enquanto nenhuma mudança significativa foi observada em manchas de cTRPV3 de cTRPV3 de compressão HEK293 (n = 5). Entretanto, 6 mM de cânfora aumentaram fortemente as aberturas de canal único em manchas internas de células HEK293 transfectadas com cTRPV3 ou cTRPV3-N427H mutantes em níveis similares (Fig. 3 C-E). Assim, um único ponto de mutação em TRPV3 de galinha aumenta especificamente sua sensibilidade para 2-APB.

A Sensibilidade 2-APB em TermoTRPs relacionados: TRPV1, TRPV2, e TRPV4.

TRPV3 mamífero está intimamente relacionado com TRPV1 (39% homologia de aminoácidos), TRPV2 (36% homologia), e TRPV4 (38% homologia). Curiosamente, o 2-APB é um agonista comum da TRPV1, TRPV2 e TRPV3, mas não da TRPV4 (18). Portanto, nós perguntamos se existe um mecanismo comum para a ação do 2-APB nesses canais iônicos relacionados. A posição equivalente do rato TRPV3 His-426 é N em TRPV1 (N419), TRPV2 (N379) e TRPV4 (N456) (Fig. 4A; Fig. S5A). A posição equivalente do rato TRPV3 R696 na caixa TRPV é também R (R701) em TRPV1, uma lisina conservada (K664) em TRPV2, e um triptofano não carregado (W737) em TRPV4 (Fig. 4A; Fig. S5A).

Focalizamos o resíduo N-terminal H, que é especificamente necessário para respostas adequadas de 2-APB para TRPV3 de mamíferos e anfíbios, e uma mutação de N para H neste resíduo é suficiente para induzir respostas robustas de 2-APB em TRPV3 de galinha. TRPV1 e TRPV2 do tipo selvagem carregam Ns na posição equivalente do TRPV3 H426, mas mostram respostas robustas ao 2-APB. Este resultado aumenta a possibilidade do TRPV1 e TRPV2 responderem ao 2-APB através de mecanismos distintos em comparação com o TRPV3. No entanto, testamos se a introdução de um H nesta posição afecta especificamente as respostas do 2-APB em TRPV2 e TRPV1. A TRPV1-N419H mutante teve respostas melhoradas tanto para 2-APB como para capsaicina, indicando um efeito não específico na expressão ou função do canal (Fig. S5B). A TRPV2-N379H mutante correspondente teve respostas similares de 2-APB e probenecid (outro agonista da TRPV2) em comparação com a TRPV2 do tipo selvagem (Fig. S5C) (30). Estes resultados sugerem que o mecanismo de ativação 2-APB da TRPV2 e TRPV1 não está completamente conservado com o da TRPV3 (ver Discussão).

Perguntamos então se os resíduos equivalentes da TRPV3-H426 e R696 são responsáveis pela falta de respostas 2-APB na TRPV4. Para abordar esta questão, mutamos resíduos de aminoácidos equivalentes em N456 e W737 na TRPV4 para H e R, respectivamente (Fig. 4A). A TRPV4 e TRPV4-W737R do tipo selvagem mostraram apenas respostas marginais de 2-APB em comparação com controles vetoriais (Fig. 4B). Contudo, notavelmente, as células HEK293 transfectadas com TRPV4-N456H responderam a 2-APB com um EC50 de 131,0 ± 3,3 μM (nHill = 2,4). Além disso, o TRPV4 com mutações duplas N456H/W737R mostrou respostas ainda mais robustas ao 2-APB, com um EC50 de 10,0 ± 0,8 μM (nHill = 1,2) (próximo do valor do rato tipo selvagem TRPV3) (Fig. 4B). As respostas ao agonista TRPV4 4-α-PDD não foram significativamente diferentes entre o TRPV4 do tipo selvagem e todos os mutantes TRPV4, sugerindo que o aumento das respostas do 2-APB não é devido ao aumento do nível de expressão do TRPV4 ou ao ganho geral de função (Fig. 4B). Registros em manchas excisadas de dentro para fora expressando TRPV4, TRPV4-N456H, TRPV4-W737R ou TRPV4-N456H/W737R revelaram atividade de canal único por 150 μM 2-APB tanto no TRPV4-N456H quanto no TRPV4-N456H/W737R, com este último mostrando respostas mais robustas (Fig. S6 B e C). Não foi observada atividade de canal único ativada por 2-APB no TRPV4 e TRPV4-W737R do tipo selvagem (Fig. S6A; e dados não mostrados). Estes resultados indicam que as diferenças nos 2 resíduos de aminoácidos identificados em nossa tela são responsáveis pela falta de sensibilidade 2-APB da TRPV4.