O potencial uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) em aplicações médicas regenerativas personalizadas pode ser aumentado pelos transgênicos, incluindo a expressão dos rótulos das células constituintes, dos repórteres de diferenciação ou dos moduladores dos fenótipos da doença. Assim, há precedência para expressão transgênica reprodutível entre subclones iPSC com antecedentes isogênicos ou genéticos diversos. Usando vetores de vírus ou transpositores, os locais de integração transgênica e números de cópias são difíceis de controlar e quase impossíveis de reproduzir através de múltiplas linhas celulares. Além disso, os transgenes aleatoriamente integrados estão frequentemente sujeitos a efeitos de posição pleiotrópica como consequência de alterações epigenéticas inerentes à diferenciação, prejudicando as aplicações em iPSCs. Para resolver este problema, adaptamos as tecnologias populares TALEN e CRISPR/Cas9 nuclease para introduzir os transgenes em loci pré-definidos e superar os efeitos de posição aleatória. AAVS1 é um locus exemplar dentro do gene PPP1R12C que permite a expressão robusta de transgenes CAG impulsionados por promotores. A segmentação por genes controla o número de cópias transgênicas, de forma que os padrões de expressão do repórter são reprodutíveis e escaláveis por ∼2-por dobra. Além disso, a expressão gênica é mantida durante a cultura iPSC humana de longo prazo e diferenciação in vitro ao longo de múltiplas linhagens. Aqui, delineamos nosso protocolo de direcionamento da AAVS1 usando vetores de doadores padronizados e métodos de construção, bem como fornecemos considerações práticas para cultura de iPSC, seleção de medicamentos e genotipagem.