Embora os ensaios de proteína tenham uma variedade de usos na pesquisa de ciências da vida, não há um único método de ensaio que seja adequado para todas as aplicações. Apesar de todos os avanços da ciência moderna, não existe um método de ensaio de proteínas que não seja afetado por nenhum componente não protéico ou pelas diferenças na composição da proteína. Por esta razão, os laboratórios de proteínas consideram necessário ter mais de um tipo de ensaio de proteínas para aplicações de pesquisa.
Cada ensaio tem as suas próprias vantagens e limitações. Assim, se você quiser obter resultados precisos de sua experiência, você deve ser capaz de selecionar o ensaio mais adequado para sua aplicação.
Tipos de ensaios de proteína colorimétrica
Baseado na química envolvida, os dois métodos mais comuns para a detecção colorimétrica e quantificação da proteína total são o ensaio de ligação proteína-dye e/ou o ensaio de quelação à base de íons de cobre.
Ensaios de ligação do corante
Ensaios de ligação do corante, tais como os ensaios de Bradford (Coomassie) e 660nm de proteína, são baseados na ligação das moléculas de proteína ao corante Coomassie sob condições ácidas. Quando as moléculas proteicas se ligam ao corante, a cor muda de marrom (Amax= 465nm) para azul (Amax= 610nm). A mudança na densidade da cor (que é lida a 595nm) é proporcional à concentração de proteína.
Os aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) desempenham um papel vital na formação de complexos de tinturas-proteínas e a mudança espectral resultante enquanto proteínas menores (menos de 3kDa) e aminoácidos não produzem mudanças de cor.
Copper Ion Based Assays
Em ensaios de proteínas à base de iões de cobre, a solução proteica é misturada com uma solução alcalina de sal de cobre para facilitar a quelação dos iões cúpricos (Cu2+) com as ligações peptídicas, e a subsequente redução dos iões cúpricos (Cu2+) a iões cúpricos (Cu+). Qualquer excesso de iões de cobre permanecerá sem ligação às ligações peptídicas e estará disponível para detecção.
Os ensaios de proteínas baseados em iões de cobre podem ser divididos em dois grupos – (1) ensaios que detectam iões cúpricos reduzidos (Cu+) e (2) ensaios que detectam iões cúpricos não ligados (Cu2+). O ácido bicinchonínico (BCA) ou Reagente folínico (ácido fosfomolíbdico/ácido fosfotúngstico) pode ser usado para detectar íons cuprosos. Após a redução do reagente utilizado, é produzida uma cor azul. A quantidade de cor produzida pode ser lida entre 650nm e 750nm e é proporcional à quantidade de ligações peptídeo.
Nota: A presença de tirosina, triptofano, cisteína, histidina e asparginina na proteína aumenta a densidade da cor resultante.
Em ensaios baseados na detecção de íons cúbicos não ligados, o cobre alcalino é misturado com a solução protéica e os íons cúbicos não ligados são então detectados com um reagente produtor de cor que reage com os íons cúbicos. A quantidade de cor produzida é inversamente proporcional à quantidade de ligação do peptídeo na amostra.
Selecting Protein Assays: Alguns factores a considerar
Há uma série de factores que deve considerar ao escolher um ensaio. Aqui estão alguns deles.
- Compatibilidade com o tipo de amostra e componentes. A natureza da amostra proteica e a presença de agentes não proteicos em soluções proteicas pode afectar significativamente os resultados da sua experiência. Tenha em mente que a presença de agentes redutores, agentes quelantes metálicos, corantes, aminas e açúcares interferem com os ensaios de proteínas à base de cobre, enquanto soluções protéicas contendo detergentes interferem com os ensaios de proteínas à base de corantes.
- Gama de ensaios e volume de amostra necessário. A maioria dos ensaios colorimétricos requer pelo menos 0,5µg de proteínas para uma estimativa confiável. Assim, para amostras difíceis de obter, métodos que requerem a menor quantidade de amostra para uma estimativa confiável devem ser considerados.
- Uniformidade proteína-para-proteína. Os ensaios de proteína baseados em corantes e aqueles que envolvem a redução de íons cuprosos a íons cupricos têm variação significativa de proteína para proteína.
- Considerações de tempo. A complexidade da amostra e o método de ensaio escolhido ditam a quantidade de tempo necessária para realizar o seu ensaio de proteína. Amostras de proteínas contendo agentes interferentes e ensaios que utilizam parcelas ou curvas padrão consumirão mais tempo.
- Requisitos de instrumentação. A disponibilidade de espectrofotômetro ou leitor de placas necessário para medir a cor produzida (absorvância) pelo ensaio também pode afetar sua escolha.
