Fármacos recombinantes a partir de células microbianas: uma actualização de 2015

Fábricas de células

Desde os tempos iniciais do ADN recombinante, a compreensão cada vez maior da fisiologia celular e do stress, e dos factores envolvidos na expressão heteróloga de genes e na produção de proteínas, capacitou o uso de diferentes fábricas vivas, nomeadamente células procarióticas e eucarióticas, plantas ou animais . Ao utilizar estes sistemas, a produção recombinante resolve problemas de disponibilidade de fontes, é considerada um processo bio-seguro e verde e confere a capacidade de modificar as sequências de aminoácidos e, portanto, a função proteica, para melhor ajustar o produto a uma função desejada . Existe um amplo e crescente espectro de sistemas de expressão que estão se tornando disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. A Escherichia coli foi a plataforma predominante quando o setor biofarmacêutico surgiu nos anos 80, e foi seguida pela implementação da levedura Saccharomyces cerevisiae. Tanto os sistemas como as metodologias genéticas associadas apresentam uma versatilidade invulgarmente elevada, tornando-os adaptáveis às diferentes exigências de produção . Apesar da exploração das células de insectos como sistema inicialmente bem sucedido, especialmente para as proteínas orientadas para a vacinação, as linhas celulares de mamíferos (sobretudo as células CHO) são hoje em dia o sistema celular derivado de animais, devido à sua adequação para produzir proteínas convenientemente glicosiladas (Fig. 1). A capacidade de realizar modificações pós translacionais contrasta com exigências nutricionais complexas, crescimento lento e fragilidade, e tempo e custos de produção relativamente elevados. Assim, entre muitos sistemas celulares convencionais e emergentes para a produção de proteínas, as linhas celulares de bactérias, leveduras e mamíferos são as mais comuns na biofarmácia, e tanto os sistemas procarióticos como eucarióticos estão em constante evolução e competem para melhorar suas propriedades e se intensificam como plataformas de escolha para a produção de medicamentos protéicos. Embora as bactérias tenham perdido seu papel inicial de liderança no campo, cerca de 30% dos biofarmacêuticos comercializados ainda são produzidos neste sistema, como suportado pela incomum manipulabilidade fisiológica e genética das células procarióticas .

De facto, o principal objectivo no desenvolvimento de novas plataformas de produção de proteínas é melhorar a funcionalidade das drogas através do sucesso da dobragem de proteínas e modificações pós-tradução, mantendo ao mesmo tempo a baixa complexidade e alta flexibilidade associadas à cultura de células procarióticas. Neste contexto, bactérias Gram-positivas como Bacillus megaterium e Lactococcus lactis permitem uma eficiente secreção protéica na ausência de componentes endotóxicos da parede celular, enquanto fungos filamentosos (como Trichoderma reesei, ), musgo (Physcomitrella patens, ) e protozoários (Leishmania tarentolae, ) promovem padrões de glicosilação semelhantes aos das proteínas de mamíferos, mas ainda sendo cultivados através de métodos mais simples do que os requeridos pelas células de mamíferos. Descrições extensivas de plataformas emergentes (bacterianas e não bacterianas) especificamente destinadas à produção de medicamentos protéicos de alta qualidade podem ser encontradas em outros lugares. O recente desenvolvimento de uma estirpe de E. coli livre de endotoxinas e sua aplicação no fabrico de proteínas e materiais proteicos abre caminho para uma produção rentável e versátil de proteínas destinadas a usos biomédicos, saltando as etapas de remoção de endotoxinas, ganhando assim em biossegurança e reduzindo os custos de produção . Espera-se que todos estes novos sistemas ofereçam em breve produtos melhorados em abordagens ainda simples e totalmente controladas de biofabricação.

Tendências em biofármacos proteicos

Nearly 400 produtos recombinantes baseados em proteínas foram produzidos com sucesso e são aprovados como biofármacos , termo que se refere a produtos terapêuticos gerados por tecnologias que envolvem organismos vivos . Outros 1300 candidatos à proteína estão em desenvolvimento, dos quais cerca de 50% estão em estudos pré-clínicos e outros 33% em ensaios clínicos (Fig. 2). Neste contexto, é previsível um aumento do número de aprovações nos próximos anos. Desenvolvido por Eli Lilly & Co na década de 70, a Humulina, uma insulina humana recombinante fabricada na bactéria E. coli , foi a primeira biofarmacêutica aprovada (pela FDA) em 1982 . Outras proteínas naturais como hormonas, citocinas e anticorpos (Orthoclone OKT3) estavam entre os nove únicos produtos aprovados na década de 1980 (Tabela 1). Atualmente, as áreas terapêuticas que mais se beneficiaram dos biofarmacêuticos recombinantes são as doenças metabólicas (por exemplo, diabetes tipo 1, tipo 2, obesidade ou hipoglicemia), doenças hematológicas (por exemplo, anemia renal, hemofilia A, sangramento ou distúrbios de coagulação) e oncológicas (por exemplo, melanoma, câncer de mama ou colorretal), com 24, 18 e 15 % das aprovações, respectivamente (Fig. 3). Neste sentido, a oncologia é um mercado em clara expansão. No período 2010-2014, 9 dos 54 biofarmacêuticos aprovados eram medicamentos antitumorais, sendo o câncer a indicação mais comum dentro deste período. Investigando as bases moleculares dos biofarmacêuticos, há uma clara tendência para produtos à base de anticorpos. No mesmo período (2010-2014), 17 dos 54 medicamentos proteicos aprovados eram anticorpos monoclonais (31,5%), em comparação com 11% entre 1980-1989 . Além disso, entre os dez principais biofarmacêuticos protéicos vendidos globalmente em 2014 (Tabela 2), seis são anticorpos ou proteínas derivadas de anticorpos (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptina; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Formerly, Os biofarmacêuticos foram versões recombinantes de proteínas naturais, com a mesma sequência de aminoácidos das respectivas versões nativas (com apenas pequenas modificações, muitas vezes resultantes da estratégia de clonagem). Desde os anos 90, uma proporção significativa das aprovações é baseada em formas altamente modificadas de proteínas recombinantes. Esta nova alternativa, baseada na fusão de proteínas ou domínios e em versões truncadas, oferece um amplo espectro de combinações possíveis para obter novos biofarmacêuticos com diferentes atividades conjuntas que não são encontradas juntas na natureza.

Drogas protéicas para tratamento do câncer

Oncologia é uma das indicações terapêuticas que dominam o mercado biofarmacêutico, já que o câncer é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A cirurgia e a radioterapia são eficazes na cura do câncer nos estágios iniciais da doença; entretanto, não podem erradicar a doença metastática. A presença de micrometástases ou metástases clinicamente evidentes no diagnóstico requer a sua utilização em combinação com quimioterapia genotóxica para aumentar as taxas de cura. No entanto, o sucesso da quimioterapia tem sido prejudicado pela sua falta de selectividade e especificidade, de modo que a toxicidade para os tecidos normais limita a dose que poderia ser administrada aos pacientes. O desenvolvimento de biofármacos capazes de inibir alvos moleculares específicos que conduzem ao câncer (por exemplo, anticorpos monoclonais anti-H2-Trastuzumab- ou anti-VEGF-Bevacizumab-) vai nessa direção .

Os biofármacos proteicos comercializados, quase 24% (94 produtos) são usados em terapias antitumorais. A maioria desses produtos é usada com fins de suporte, com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais da quimioterapia, geralmente neutropenia ou anemia (alguns exemplos representativos são mostrados na Tabela 3). Dezenove desses 94 produtos são verdadeiros medicamentos antitumorais, 69 % dos quais são produzidos em E. coli (Fig. 4) e são baseados em sequências de aminoácidos artificiais, fusões de proteínas e domínios proteicos únicos (Tabela 4).

Claramente, As versões modificadas de proteínas são as mais abundantes em terapias do câncer sobre os polipéptidos naturais. Como exemplos relevantes, o Ziv aflibercept é uma proteína de fusão recombinante produzida em células CHO utilizadas contra o câncer colorretal. Ela consiste em porções de cada Receptores de Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGFR1 e VEGFR2) fundidas à fração constante (Fc) de uma imunoglobulina IgG1 humana (Fig. 5). Essa construção atua como chamariz ligando-se ao VEGF-A, VEGF-B e ao fator de crescimento placentário (PlGF), que ativam o VEGFR. Essa armadilha dificulta a interação entre os fatores de crescimento e os receptores, inibindo a via VEGF que está envolvida no processo angiogênico. A denileucina diftitox é uma proteína recombinante composta de dois fragmentos de toxina da difteria (A e B) e uma interleucina-2 humana (Fig. 5). A difteria toxina é uma potente exotoxina secretada pela Corynebacterium diphteriae. Devido à sua estrutura peculiar, todo o complexo, produzido em E. coli, é capaz de fornecer um agente citotóxico diretamente a um alvo específico. Existem dois blocos ativos principais cuja função é, em primeiro lugar, fornecer seletivamente o biofarmacêutico (IL-2) e, em segundo lugar, causar citotoxicidade (toxinas A e B). A proteína de fusão liga-se ao receptor IL-2, que é expresso em células cancerosas (linfoma cutâneo de células T). Uma vez que a toxina é internalizada, o domínio catalítico promove a morte celular através da inibição da síntese protéica .

Como a entrega de medicamentos direcionados para o câncer é uma área de pesquisa mais recente e em expansão, outros biofarmacêuticos não recombinantes, baseados em proteínas também estão fortemente representados. Estes incluem principalmente conjugados antifármacos (ADCs) como Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine, ou conjugados nanopartículas, como nab-paclitaxel . Nestes casos, a contraparte proteica actua como um veículo direccionado para as drogas químicas convencionais. Mais uma vez, essa abordagem busca a entrega seletiva de medicamentos a células-alvo específicas, visando aumentar a atividade antitumoral e, ao mesmo tempo, reduzir a toxicidade em células normais e os efeitos colaterais associados.

Produtos contra o câncer que proporcionaram as maiores receitas em 2013 estão representados na Fig. 6. Sessenta por cento desses produtos são proteínas recombinantes, apoiando a idéia de que a produção de proteínas recombinantes ainda é uma plataforma crescente e promissora, oferecendo espaço para importantes avanços no setor biofarmacêutico.