Frontiers in Microbiology

Introdução

Bacteriófagos entraram em foco da pesquisa científica, pois eles desempenham um papel importante em quase todas as comunidades microbianas. Como predadores virais de bactérias, eles têm uma influência substancial nas populações microbianas e na dinâmica em diferentes ambientes. Há várias revisões que tratam do papel dos bacteriófagos em diferentes habitats como os mares ou o corpo humano (Clokie e Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). Desde a sua descoberta há mais de 100 anos, separadamente por Frederick Twort e depois por Felix D’Herelle (Salmond and Fineran, 2015), os bacteriófagos têm sido utilizados nos países da Europa Oriental para o tratamento médico de infecções bacterianas, enquanto que no resto do mundo os antibióticos foram os protagonistas (Myelnikov, 2018). Atualmente, como as infecções com bactérias multi-resistentes se tornaram uma ameaça mundial (Zaman et al, 2017), pacientes de todo o mundo são tratados no Instituto Eliava de Bacteriófagos, Microbiologia e Virologia, em Tbilisi, Geórgia, que tem talvez a mais longa experiência em terapia bacteriófaga (Kutateladze e Adamia, 2008), e também na Unidade de Terapia Bacteriófaga do Instituto Ludwik Hirszfeld de Imunologia e Terapia Experimental em Wrocław, Polónia (Międzybrodzki et al., 2012). A aplicação de bacteriófagos pode ser uma solução valiosa não só no setor médico, mas também em outros campos onde as bactérias podem ter um impacto negativo.

algumas empresas nos Estados Unidos, como a OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Estados Unidos da América) e Intralytix Inc. (Intralytix Inc., Estados Unidos da América). (Baltimore, MD, Estados Unidos) desenvolveram diferentes produtos bacteriófagos para a aplicação como desinfectantes na indústria alimentar que podem ser usados contra Salmonella, Escherichia coli e Listeria monocytogenes. Na Europa, uma empresa holandesa Micreos BV (Wageningen, Holanda) também comercializou produtos bacteriófagos contra Salmonella e E. coli e uma empresa alemã, Fink Tec (Hamm, Alemanha), visando E. coli (Moye et al., 2018). Espera-se uma maior aplicação de bacteriófagos na cadeia de valor alimentar, incluindo a agricultura e a aquacultura, onde um largo espectro de diversos patogénios de plantas e peixes causa perdas económicas significativas (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Embora alguns produtos bacteriófagos já estejam a ser comercializados, um processo eficaz, constante e controlável para a produção de bacteriófagos ainda não foi alcançado. A produção de fagos em laboratórios pode ser considerada um processo de rotina, e os protocolos são bem definidos; no entanto, estes processos não são facilmente escalonados. As entidades industriais têm o principal interesse em obter métodos confiáveis para a produção de fagos que permitam a escalada do processo. Entretanto, a solução não é fácil, devido à natureza biológica do sistema e aos diversos tipos de interações que ocorrem entre fagos e bactérias.

Têm havido várias tentativas de gerar métodos confiáveis para a produção de bacteriófagos. Alguns pesquisadores utilizaram uma abordagem teórica com modelos de simulação, enquanto outros adotaram a abordagem prática através de experimentos. Esta mini-revisão examina exemplos selecionados de ambas as abordagens, contrastando suas principais diferenças.

Generalidades na Produção de Bacteriófagos

A natureza biológica dos bacteriófagos força sua reprodução na célula hospedeira. Portanto, um método de produção de bacteriófagos requer um processo de produção envolvendo pelo menos duas unidades operacionais, crescimento das bactérias hospedeiras e propagação (ou infecção) de bacteriófagos. É importante considerar parâmetros básicos para o crescimento bacteriano e a infecção por fagos, tais como os substratos seleccionados para a bactéria e a temperatura óptima, tanto para o crescimento bacteriano como para a infecção por fagos, uma vez que estes factores podem influenciar a infecciosidade dos fagos (Tokman et al., 2016). Da mesma forma, é importante conhecer a biologia do fago a ser produzido, incluindo os diferentes parâmetros de infecção, como taxa de adsorção, tamanho do estouro e período latente; no entanto, como será discutido posteriormente, estes parâmetros podem mudar dependendo das condições de infecção (Santos et al., 2014). Mais importante, recomenda-se ter um conhecimento profundo das interacções específicas que podem ocorrer entre o hospedeiro bacteriano e o fago seleccionado, tais como a presença de um sistema CRISPR-cas na bactéria, porque estes factores podem ter uma forte influência no processo de infecção do fago (Levin et al., 2013). Recomenda-se também a selecção de uma estirpe bacteriana não virulenta como hospedeiro. A produção de bacteriófagos a nível industrial exigirá grandes quantidades da bactéria hospedeira, evitando assim o uso de patógenos virulentos resistentes a drogas, e especialmente patógenos multi-resistentes devem ser obrigatórios num processo de produção de fagos (Torres-Barceló, 2018). O mesmo se aplica para bactérias portadoras de profágenos, pois eles poderiam ser induzidos durante o processo, alterando o resultado final (Stewart e Levin, 1984).

Um processo confiável para a produção de bacteriófagos em larga escala pode ser muito elusivo, pois os dados obtidos em laboratório nem sempre são úteis para a ampliação dos processos biológicos (Kwok, 2010). Os pesquisadores tentaram preencher esta lacuna principalmente através de estudos sobre a produção de bacteriófagos com base em simulações computadorizadas, algumas delas validadas experimentalmente. Aqui, vamos analisar primeiro estudos teóricos focados em modelos de produção de fago e depois estudos selecionados que foram validados experimentalmente. Todos os casos concordam com os critérios do ensaio para posterior purificação e validação de um produto baseado em bacteriófagos, e alguns deles estão incluídos em ambas as seções (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Modelos teóricos para produção de bacteriófagos

Para descrever um processo de produção de fago através de um modelo matemático é importante definir os parâmetros cinéticos a serem incluídos no modelo. Os três parâmetros básicos para a produção de fagos são as populações de bactérias sensíveis não infectadas, bactérias infectadas por fagos e fagos livres (Krysiak-Baltyn et al., 2016). A partir daí, diferentes modelos incluíram variáveis adicionais como bactérias resistentes não infectadas (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) ou múltiplas espécies bacterianas (Levin et al., 1977). Todas estas populações interagem controladas por parâmetros cinéticos associados ao crescimento bacteriano e à infecção por fagos. Considera-se bem conhecido quais constantes são importantes para as bactérias; no entanto, isto ainda está em discussão para os bacteriófagos. Há consenso de que constante de adsorção, período de latência e tamanho do estouro são variáveis importantes a considerar; no entanto, a sua relevância no modelo varia entre diferentes estudos. Além disso, diferentes autores utilizam nomenclatura diferente para definir os parâmetros cinéticos, o que é uma das principais dificuldades para estabelecer comparações entre diferentes modelos e para unificar o conhecimento geral sobre este tema. Por exemplo, a taxa de adsorção de fagos (indicador de partículas de fago adsorvidas a bactérias) é comumente referida pelo símbolo “δ”; entretanto, Beretta e Kuang (1998) usaram o símbolo “K”, que também pode ser o símbolo da constante de especificidade de substrato “Ks” de Monod. Outros exemplos de nomenclatura diferente podem ser encontrados na Tabela 1. Como em outros processos biológicos, espera-se que os autores que trabalham no campo dos modelos de crescimento de fagos-bactérias concordem em um vocabulário algébrico específico ou incluam uma explicação clara de termos e unidades em seus artigos e uma nomenclatura clara, como recentemente afirmado por Krysiak-Baltyn et al. (2018). Com base na nomenclatura utilizada por outros autores (Tabela 1) propomos o uso de caracteres gregos para nomear os diferentes parâmetros cinéticos na reprodução de fagos. O tamanho da explosão pode ser simbolizado por β, a taxa de adsorção por δ, o tempo de eclipse por ε e a taxa de decaimento do fago por λ. As únicas exceções seriam a concentração de fago, comumente conhecida como “P”, e o tempo de latência, conhecido como “L”. A uniformidade nesta linguagem matemática facilitará a compreensão e a mineração de dados para futuros revisores acadêmicos ou industriais.

Começam com Campbell (1961), muitos esforços têm sido feitos para descrever modelos de produção de bacteriófagos, descrevendo o comportamento da população de fagos sob várias condições e métodos. A Tabela 1 resume diferentes modelos de produção de fago, dados como equações diferenciais ou integrais (dependendo da decisão de cada autor), mencionando considerações específicas para cada modelo.

Modelos de produção de fago são geralmente consistentes na descrição da mudança da população de fago ao longo do tempo. Isto pode ser representado como uma mudança cinética em partículas de fago ou unidades formadoras de placas (PFU) por unidade de tempo, concentrações finais obtidas após um processo batch, ou durante um período de tempo em um processo contínuo. Apesar do consenso geral, estes modelos diferem em várias afirmações. Os modelos propostos por Campbell (1961) e Beretta e Kuang (1998) são consistentes em equilibrar partículas de fago com termos de geração (liberação de partículas de bacteriófago por unidade de tempo) e perda de bacteriófago livre devido a taxas de adsorção ou decaimento; estes modelos são úteis devido à sua simplicidade e ao uso de parâmetros padrão de crescimento de fago como taxa de adsorção, tamanho de ruptura e tempo de latência, e são uma forma rápida de simular processos de produção em lote, mas não poderiam se ajustar a processos como populações de bactérias resistentes ou evolução de fago ao longo do tempo. Esses modelos também tendem a subestimar a influência de parâmetros como tamanho de estouro e período latente, enquanto modelos mais recentes têm mostrado a importância desses parâmetros e como eles podem variar dependendo de outros fatores (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

Um modelo interessante proposto recentemente por Santos et al. (2014) considera a influência da taxa de crescimento bacteriano na constante de adsorção de fagos e uma equação de distribuição normal que rege os valores do período latente, levando em conta a variabilidade desses parâmetros. Este modelo provou ser muito útil porque proporciona a oportunidade de avaliar a influência do substrato na produção de fagos e a inclusão da taxa de crescimento bacteriano no modelo oferece uma ferramenta indireta para considerar o estado fisiológico das bactérias durante o processo. A dependência dos parâmetros de infecção por bacteriófagos na taxa de crescimento bacteriano foi posteriormente explorada também por outros autores (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al, 2018b); Nabergoj e colegas descobriram que o tamanho da ruptura aumentou linearmente com a taxa de crescimento bacteriano, enquanto a constante de adsorção e o período de latência diminuíram.

Outros modelos exploraram a influência de múltiplas espécies bacterianas, e a ocorrência de resistência bacteriana (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Embora o objetivo destes estudos nem sempre tenha sido desenvolver métodos de produção de fago, eles são úteis para descrever situações potenciais do que podem ocorrer durante o processo. Estes modelos incluem variáveis associadas à selecção de resistência bacteriana e taxas de reversão em função da população bacteriana (disponibilidade de bactérias menos ou mais susceptíveis ao longo do tempo), definindo condições nas quais bactérias susceptíveis e resistentes podem coexistir, tais como uma forte desvantagem selectiva em bactérias resistentes (por exemplo, menor taxa de crescimento), e/ou a existência de um refúgio espacial (ou refúgio de densidade) onde (abaixo do qual) o fago não é capaz de infectar as bactérias. Chaudhry et al. (2018) ofereceram uma explicação interessante de como os fagos podem persistir em populações dominadas por bactérias resistentes, sugerindo que estas últimas poderiam produzir bactérias sensíveis em frequências que permitissem a replicação dos fagos. Curiosamente, este fenômeno já foi sugerido anteriormente (Bastías et al., 2010). A geração de cepas resistentes a fagos em sistemas de produção de fagos pode ser motivo de preocupação e, portanto, deve ser incluída no desenvolvimento de novos métodos, para minimizar essa possibilidade. Vários autores sugeriram que este problema pode ser evitado com o setup de produção de fagos, que será discutido na próxima seção.

Um outro estudo interessante é o de Krysiak-Baltyn et al. (2018), que também incorpora parâmetros variáveis de infecção em função da taxa de crescimento bacteriano, e estima o custo operacional e a produtividade em um sistema de processo simulado em dois estágios. Uma das conclusões importantes deste estudo teórico é que a concentração ideal do substrato para o crescimento bacteriano não deve ser necessariamente a mesma para a produção de bacteriófagos e, de acordo com a sua análise, o custo por ml de fagos a uma concentração de 4 × 1010 fagos/mL pode ser tão baixo quanto $ 1,78 × 10-2. Seria interessante ter uma validação experimental desta estimativa e determinar como ela se adapta a diferentes economias ou países.

Finalmente, a evolução dos fagos bacteriófagos também deve ser considerada em um processo de produção, uma vez que os fagos podem aumentar ou diminuir sua eficiência para infectar bactérias ao longo do tempo (Lenski e Levin, 1985). Este conceito poderia ser representado como taxas de infecção em experimentos de host-range, onde mesmo métodos de expansão de host-range podem ser alcançados para aplicações de terapia com fagos (Mapes et al., 2016). Esta situação foi simulada em culturas em lote, mostrando que o aparecimento de mutantes fagos é fortemente dependente da flexibilidade genética dos fagos (taxas de mutações) (Levin e Bull, 2004). A capacidade de prever a evolução dos fagos durante a produção seria útil para estabelecer um processo de produção minimizando a probabilidade de alterar as propriedades líticas dos fagos. Os artigos revisados mostram que os modelos de produção de bacteriófagos são uma abordagem importante que pode ajudar a encontrar as melhores estratégias, entretanto, eles precisam ser validados experimentalmente.

Experimental Experiences in Bacteriophage Production

Existem vários estudos práticos envolvendo a produção de fagos. Alguns são focados na produção de fago em biorreatores, enquanto outros focam na avaliação e otimização do processo. Como esperado, estas experiências também consideram uma etapa de crescimento bacteriano e infecção/propagação de fagos em frascos e bioreatores (Tabela 2). Estes dados são úteis para dar uma visão de como certos modelos de bacteriófagos hospedeiros podem ser usados para propagação e aumentar os níveis de produção de fagos. Os sistemas host-phage mais comuns usados são as estirpes de E. coli e seus fagos, provavelmente devido à quantidade de informação relativa a esses sistemas bacteriófagos (E. coli phages T3, T4 e T7) e à falta de informação sobre outros sistemas bacteriófagos.

De acordo com um caso relatado, os títulos obtidos podem ser de 1,2 × 1016 PFU mL-1 em um biorreator de lote (5 L) (Sochocka et al., 2015). Este nível de produção concorda com a produção necessária para fins terapêuticos (>1 1010 PFU mL-1), considerando as etapas de purificação, a taxa de decaimento dos fagos e a estabilidade ou prazo de validade (Naghizadeh et al., 2018). Outros autores também relataram níveis promissores de produção de 5 × 1012 PFU mL-1 em 1,2 L (Warner et al., 2014), e 2,4 × 1013 PFU dia-1 em 1 L (Nabergoj et al., 2018a; Tabela 2).

É difícil estabelecer comparações sobre qual método poderia ser mais eficiente, uma vez que eles utilizam diferentes procedimentos de cultura e diferentes sistemas hospedeiro-bacteriófagos. A cultura em lotes é a forma mais barata (não a mais simples) de produzir bacteriófagos, mas é altamente limitada pelo volume máximo do equipamento disponível, tempo total de operação e disponibilidade do substrato (concentrações mais elevadas podem ser inibitórias para o crescimento bacteriano). A cultura contínua tem maior escalabilidade ao optimizar a taxa de diluição bacteriana através da modificação do fluxo de entrada e saída. Além disso, a regulação da taxa de diluição permitirá o controlo directo da taxa de crescimento bacteriano, o que tem uma influência directa nos parâmetros de infecção como o tamanho do rebentamento, constante de adsorção e período de latência (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). A taxa de diluição também pode ser usada para aumentar a produtividade do sistema, como foi mostrado por Nabergoj et al. (2018a), onde uma produtividade máxima de 109 fagos mL-1 h-1 foi alcançada com uma baixa taxa de diluição de 2 h-1 em um sistema de 1 L cellstat. Um sistema operacional contínuo pode ser permanentemente operacional, sendo, portanto, a forma mais conveniente de produzir um produto biotecnológico para uma empresa. No entanto, a sua implementação é difícil e cara, exigindo um monitoramento constante para manter o estado estável. Um processo totalmente contínuo de crescimento bacteriano e produção de bacteriófagos poderia aumentar a probabilidade de ocorrência de resistência bacteriófaga se não forem adotadas contramedidas específicas (Middelboe et al., 2001).

Alguns autores sugeriram a implementação de processos em dois estágios, um exclusivamente para produção de bactérias e outro para propagação de fagos (Schwienhorst et al., 1996; Sauvageau e Cooper, 2010; Nabergoj et al., 2018a). Isto pode ser conseguido com um sistema cellstat, onde dois biorreactores são ligados em série com um fluxo constante através do sistema. Neste caso, o fluxo entre os reactores e o volume em cada reactor (e taxa de diluição e taxa de crescimento bacteriano por adição) pode ser controlado de forma a atingir a máxima produtividade (Nabergoj et al., 2018a). Outra configuração interessante proposta por Sauvageau e Cooper (2010) consiste em um sistema semi-contínuo de dois estágios, autociclagem. Neste caso, cada estágio funciona de forma semelhante a uma cultura em lote, onde as bactérias são primeiro cultivadas separadamente do fago, e depois introduzidas no estágio de propagação do fago quando uma concentração apropriada é alcançada, permitindo assim o início do processo de infecção usando uma multiplicidade de infecção desejada (Kasman et al., 2002). Esta configuração também tem a vantagem de não requerer monitoramento permanente para manter o estado estável dos sistemas contínuos, e tem sido usada para obter produtividade de 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau e Cooper, 2010). Ambos os exemplos, o sistema cellstat e o processo de autociclagem em duas fases, têm a grande vantagem de que as bactérias são cultivadas na ausência de fagos, portanto a resistência bacteriófaga não é favorecida durante o processo.

Finalmente, é importante notar que existem alguns parâmetros que nem sempre são relatados em estudos sobre a produção de bacteriófagos. Por exemplo, parâmetros como proporção de aeração ou entrada de ar no biorreator são mencionados apenas em dois relatórios (Sauvageau e Cooper, 2010; Santos et al., 2014), embora este seja um dos parâmetros mais importantes na produção de bactérias a nível industrial. Informações sobre outros parâmetros como transferência de energia, utilização de diferentes substratos, projeto do biorreator, agitação, hélices e materiais de construção na produção de bacteriófagos são escassas ou inexistentes.

Conclusão final

A redescoberta do uso potencial de fagos em um amplo espectro de aplicações é muito empolgante e promissora. As evidências sugerem que devem ser preferidos sistemas de produção de bacteriófagos que reduzam a probabilidade de ocorrência de resistência bacteriófaga, tais como o cellstat ou um processo de autociclagem em duas fases. Estas opções também permitiriam controlar variáveis para aumentar a produtividade do processo. No entanto, os modelos de produção de bacteriófagos estão longe de ser estabelecidos e podem ser melhorados de várias maneiras. Existem ainda muitos desafios a serem superados. São necessários mais estudos sobre produção otimizada de bacteriófagos em larga escala, custos de infra-estrutura e equipamentos, diferentes preocupações de segurança e dosagem de aplicação, e a experiência sugere que estes desafios devem ser enfrentados com esforços colaborativos de parceiros acadêmicos e industriais.

Finalmente, é importante notar que a maioria dos modelos para a produção de bacteriófagos pode ser aplicada dentro de uma gama específica de valores para parâmetros de infecção por fagos e crescimento bacteriano. Portanto, independentemente dos importantes avanços nos modelos e configurações de produção de fago, o profundo conhecimento do sistema específico de fago bacteriófagos será sempre o primeiro requisito para estabelecer um sistema eficiente de produção de fago.

Contribuições dos autores

RG, SL, e RB conceberam o trabalho e escreveram o manuscrito. KG, GH, e JR escreveram as seções do manuscrito. Todos os autores contribuíram para a revisão bibliográfica, revisão do manuscrito, leram e aprovaram a versão submetida.

Funding

Este trabalho foi financiado pelo CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 e Postdoctorado PUCV 2018.

Conflito de interesses

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que pudesse ser interpretada como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

RG agradece CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL obrigado Postdoctorado PUCV 2018.