Frontiers in Oncology

Introduction

Gliomas são os tumores intracranianos mais comuns, representando aproximadamente 70% de todos os tumores cerebrais primários (1, 2). É sabido que a ressecção bruta total correlaciona-se com a melhora da sobrevida global e sem progressão em pacientes com gliomas de baixo grau (LGGGs) (3-6). Assim, a ressecção máxima segura dos LGGs é considerada hoje em dia como o tratamento primário recomendado para retardar uma potencial transformação maligna (7, 8). Entretanto, essa ressecção máxima segura só é alcançada na minoria dos LGGs devido ao seu crescimento infiltrativo e bordas indefinidas (9).

A cirurgia com ácido 5-aminolevulínico (ALA) induzido pela fluorescência protoporfirina IX (PpIX) foi introduzida no campo neurocirúrgico para melhor visualização intra-operatória do tumor (10). Nas últimas duas décadas, tais ressecções guiadas por fluorescência foram especialmente aplicadas para otimizar a cirurgia de gliomas de alto grau (HGGs) (11). Neste sentido, a cirurgia guiada por fluorescência de 5-ALA resulta em uma frequência significativamente maior de ressecções completas e uma sobrevida prolongada sem progressão em HGGs (12-17). Nos últimos anos, o 5-ALA foi também cada vez mais investigado durante a cirurgia de LGGs radiologicamente suspeitos (3, 7, 11, 13, 18-21). De acordo com os dados destes primeiros estudos clínicos, a fluorescência induzida pelo 5-ALA é um marcador poderoso para identificar potenciais regiões de transformação maligna (focos anaplásicos) durante a cirurgia de suspeita de LGGG e, assim, evitar a ausência de decomposição histopatológica. Entretanto, a maioria dos LGGG puros não pode ser visualizada por fluorescência visível de acordo com a literatura atual (3, 7, 11, 13, 18, 19, 21, 22).

Os mecanismos exatos do acúmulo de PpIX e, portanto, a presença ou ausência de fluorescência 5-ALA induzida visível nos gliomas ainda não estão claros. Uma grande variedade de fatores foi suspeita de influenciar a fluorescência visível de 5-ALA, tais como aumento do metabolismo e up-regulation das enzimas produtoras de porfirina (23), redução do metabolismo do ferro dentro das células neoplásicas (24), e redução da atividade da enzima ferrochelatase que converte a PpIX fluorescente em heme (25). Recentemente, um estudo in-vitro relatou que drogas antiepilépticas (DEA) resultam em lesão da membrana mitocondrial e, portanto, levam à inibição da síntese de PpIX nas células de glioma (26). Atualmente, os DEA são freqüentemente administrados a pacientes que sofrem de LGG antes da cirurgia. Hipótese é que a administração de DEA poderia influenciar a presença de fluorescência visível nos DEA durante a ressecção cirúrgica.

O objetivo do presente estudo foi, portanto, investigar o papel da fluorescência induzida por 5-ALA na cirurgia de LGG e analisar a influência dos DEA na presença de fluorescência visível.

Materiais e Métodos

População Paciente

Patientes que foram submetidos à ressecção de um LGGG suspeito recentemente diagnosticado no Instituto Neurocirúrgico Burdenko após a administração de 5-ALA entre março de 2014 e março de 2016 foram recrutados. Em nosso estudo, no total, 27 pacientes com um LGGG confirmado histopatologicamente foram finalmente incluídos. Nossa coorte do estudo incluiu 19 homens e oito mulheres com idade média de 33 anos (faixa etária: 18-66 anos). Segundo nossa análise histopatológica, 14 astrocitomas difusos, 6 oligodendrogliomas, 4 astrocitomas pilocíticos, 2 astrocitomas gemistocíticos e um ganglioglioma desmoplásico infantil foram diagnosticados. A aplicação de 5-ALA durante a cirurgia foi viável em todos os 27 pacientes. Em nenhum dos nossos pacientes, ocorreram efeitos colaterais significativos relacionados ao 5-ALA em nosso estudo. O consentimento informado para o procedimento cirúrgico e a administração do 5-ALA foi obtido de todos os pacientes. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Moscou, Rússia).

Critérios de Inclusão e Exclusão

Critérios de inclusão para inscrição neste estudo foram: ≥18 anos, LGGG suspeito de RM, possível ressecção total bruta (GTR) (i.e, >90%) a julgar pela estimativa cirúrgica pré-operatória, ausência de qualquer história conhecida de doença hepática ou sinais de disfunção hepática significativa e escala de Karnofsky ≥70. Os critérios de exclusão para a administração de 5-ALA foram história de fotosensibilidade, história de porfíria, gravidez e amamentação, paciente ou familiar. Somente pacientes com diagnóstico de LGG após cirurgia permaneceram na coorte final do estudo.

Procedimento cirúrgico

Patientes foram administrados por via oral 25 mg/kg de peso corporal 5-ALA (“Alasence” NIOPIK, Moscou, Rússia) dissolvidos em 100 ml de água ~3 h antes da cirurgia. Dependendo da localização do tumor, foi realizada neuromonitorização intra-operatória com potenciais evocados sensoriais/motores, e/ou estimulação direta (Viking Select, Nicolet; n = 21 pacientes), bem como cirurgia acordada (n = 2 pacientes). Foi utilizado um microscópio neurocirúrgico modificado (Carl Zeiss OPMI Pentero, Alemanha) equipado com um módulo de luz UV fluorescente de 400 nm e filtros específicos. A remoção microcirúrgica do tumor foi realizada usando principalmente microscopia de luz branca padrão com assistência de neuronavegação na maioria dos casos (n = 20 pacientes). Durante a cirurgia, o microscópio foi trocado para luz de excitação azul violeta repetidamente para visualizar a potencial fluorescência.

A intensidade de fluorescência foi avaliada visualmente por um cirurgião e determinada como “fraca” com apenas uma pequena parte do tumor mostrando fluorescência rosa com seu volume não fluorescente, “moderada” com mais da metade do tumor revelando fluorescência rosa, e “brilhante” com a maior parte do tumor parecendo vermelho brilhante. A Fluorescência assistida por espectroscopia foi avaliada quantitativamente em 12 pacientes. O nível de fluorescência variou de 0 a 15 unidades arbitrárias (após a normalização dos dados) em relação ao cérebro intacto. Não destacamos especialmente o papel da espectroscopia, pois ela foi realizada apenas em alguns de nossos pacientes. Além disso, também foi determinada a homogeneidade da fluorescência intratumoral de cada tumor. Neste sentido, a fluorescência difusa foi definida como o brilho homogêneo de todo o tumor. Em contraste, a fluorescência focal foi definida como uma área circunscrita de fluorescência dentro de um tumor que, de outra forma, não seria fluorescente. No decorrer da cirurgia, amostras de tecido de áreas fluorescentes e/ou não fluorescentes dentro do tumor e/ou da suposta borda do tumor foram posteriormente coletadas para análise histopatológica. Para evitar fototoxicidade potencial relacionada a 5-ALA, todos os pacientes foram protegidos de fontes de luz forte por pelo menos 24 h após a administração do medicamento.

Histopatologia

Amostras de tecido fixadas em formol e incluídas em parafina foram processadas para coloração de hematoxilina e eosina (H & E). O diagnóstico tumoral foi estabelecido por um neuropatologista experiente, de acordo com os atuais critérios histopatológicos da Organização Mundial de Saúde (OMS) (27). Em nosso estudo, a densidade celular e a taxa de proliferação (índice de marcação Ki-67) foi investigada em cada uma das amostras de tecido coletadas.

Consumo pré-operatório de DEA

Desde que o foco principal de nosso estudo foi investigar a potencial influência dos DEA na fluorescência induzida por 5-ALA, documentamos em cada paciente se os DEA eram administrados antes da cirurgia (sim ou não). Os pacientes foram ingeridos com doses médias de DEA: ácido valpróico (até 1,5 mg por dia), levetiracetam (800 mg por dia). Não estudamos cada droga separadamente, pois a série geral não foi grande.

Curso Pós-operatório

O estado neurológico de cada paciente foi investigado antes e após a cirurgia para detectar potencial deterioração pós-operatória dos sintomas neurológicos. Além disso, a extensão da ressecção foi avaliada de acordo com os resultados de uma RM pós-operatória precoce (até 72 h após a cirurgia): (1) GTR estava presente se pelo menos 90% da massa tumoral foi removida, (2) ressecção subtotal se mais de 50% da massa tumoral foi ressecada, e (3) ressecção parcial se <50% do tumor foi removido.

Análise estatística

O processamento de dados foi realizado utilizando o software R para computação estatística (versão 3.4.4). As variáveis contínuas foram comparadas em grupos usando o teste Mann-Whitney U-test. Para analisar a relação entre as variáveis categóricas, foi aplicado um teste exato de Fisher. Uma análise de regressão logística foi realizada para ajustar os confundidores ao testar o efeito do DEA na fluorescência. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos para p < 0,05,

Resultados

5-ALA Fluorescência Induzida e Diagnóstico Histopatológico

Nós observamos fluorescência visível durante a cirurgia em 14 (52%) dos 27 casos, enquanto nenhuma fluorescência foi detectada nos 13 casos restantes (48%).

De acordo com o diagnóstico histopatológico do tumor, todos os 4 astrocitomas pilocíticos, todos os 2 astrocitomas gemistocíticos, e o único ganglioglioma desmoplásico infantil apresentaram fluorescência visível. Além disso, a fluorescência visível foi encontrada em 4 (29%) dos 14 astrocitomas difusos, e 3 (50%) dos 6 oligodendrogliomas. De acordo com a homogeneidade da fluorescência intratumoral (n = 14 casos), 7 tumores tinham fluorescência visível “difusa”, enquanto os outros 7 gliomas tinham sítios “focais” de fluorescência visível. Detalhes sobre os dados de fluorescência de nossa coorte são fornecidos na Tabela 1 e casos ilustrativos na Figura 1.

5-ALA Fluorescência Induzida e Parâmetros Histológicos

Junto, 80 amostras de tecido foram coletadas durante a cirurgia dos 27 pacientes (mediana: 3 amostras; intervalo de 1-12 amostras por paciente). Destes, a fluorescência visível foi encontrada em 21 amostras (26%), enquanto 59 amostras (74%) não mostraram fluorescência visível. A densidade celular foi significativamente maior em amostras com fluorescência positiva (2.180 mm2) do que em amostras com fluorescência negativa (1.510 mm2; p = 0,03). Além disso, a taxa de proliferação avaliada pelo índice de rotulagem Ki-67 também foi significativamente maior em amostras fluorescentes positivas (2,52%) do que em amostras fluorescentes negativas (0,41%; p = 0,04).

5-ALA Fluorescência Induzida e DEA

Devido a uma história prévia de convulsões pré-operatórias, 15 pacientes (56%) da nossa coorte de estudo estavam tomando DEA antes da cirurgia (finlepsina, levetiracetam, trileptal e/ou ácido valpróide). Dos 15 pacientes com ingestão de DEA pré-operatória, 11 pacientes (73%) não apresentaram fluorescência visível durante a ressecção. Em contraste, 10 (83%) dos 12 pacientes restantes sem ingestão prévia de DEA mostraram fluorescência visível. Assim, a fluorescência visível foi significativamente mais comum em pacientes sem ingestão de DEA do que em pacientes com ingestão de DEA pré-operatória. O DEA mostrou ser um fator significativo (p = 0,048) influenciando a probabilidade de fluorescência intra-operatória quando ajustado para outros potenciais confundidores (astrocitoma/não-astrocitoma, localização frontal, dose de dexametasona) em um modelo de regressão logística. Os outros fatores incluídos no modelo não mostraram relação significativa com a fluorescência (p > 0,05).

Curso pós-operatório

Após a cirurgia, 21 pacientes mostraram estabilidade e quatro pacientes melhoraram os sintomas neurológicos. Em contraste, a deterioração dos sintomas neurológicos foi encontrada nos dois pacientes restantes. De acordo com a RM pós-operatória precoce, a ressecção total bruta foi alcançada em 16 pacientes (59%), a ressecção subtotal em 8 pacientes (30%) e a ressecção parcial em três pacientes (11%). A fluorescência não se correlacionou com a extensão da ressecção.

Discussão

O uso da fluorescência induzida por 5-ALA está se tornando cada vez mais popular com o objetivo de maximizar a extensão da ressecção especialmente em HGG e, assim, melhorar o prognóstico pós-operatório dos pacientes. Neste sentido, a cirurgia guiada por fluorescência demonstrou melhorar significativamente a taxa de ressecções completas no HGG em comparação com a microcirurgia isolada, e esta técnica inovadora também quase dobrou a progressão de 6 meses de sobrevida livre (16). Recentemente, foi encontrada fluorescência visível de PpIX também em outras lesões cerebrais como meningiomas (19), e tumores metastáticos (18, 28).

Literatura atual: 5-ALA Fluorescência em LGG

Até o momento, o valor de 5-ALA fluorescência induzida em LGG só foi investigado em poucos estudos. Neste sentido, Ishihara et al. descreveram pela primeira vez em 2007 a aplicação de 5-ALA em dois LGG e não encontraram nenhuma fluorescência visível nas múltiplas amostras de tecido coletadas (29). Além disso, Ruge et al. publicaram em 2009 um relato de caso de uma menina de 9 anos que foi submetida à ressecção guiada por fluorescência de um xantoastrocitoma pleomórfico do lobo temporal direito e detectaram fluorescência visível do tumor (20). Além disso, Stockhammer et al. publicaram em 2009 um relato de caso de astrocitoma difuso OMS grau II com densidade celular moderada, densidade microvascular mais alta e fluorescência visível (30). Casos de fluorescência de astrocitoma pilomyxoid e astrocitoma pilocítico foram publicados por Bernal Garcia et al. (31) e Choo et al. (32), respectivamente. A primeira série de pacientes com LGG e 5-ALA foi publicada por Widhalm et al. (33). Neste estudo, todos os oito gliomas difusamente infiltrados de grau II da OMS não mostraram nenhuma fluorescência visível induzida por 5-ALA durante a cirurgia. Em outro estudo, Ewelt et al. relataram em 2011 fluorescência visível em apenas um (8%) dos 13 LGGG durante a cirurgia (7). Três anos após a primeira série de pacientes, Widhalm et al. publicaram uma série maior em 2013 e encontraram fluorescência visível em 4 (9%) de 33 LGGs (34). Em outro estudo de Marbacher et al., 8 (40%) de 20 LGGGs mostraram fluorescência visível (18). Em 2015, Valdes fundou a fluorescência visível em 4 (33%) dos 12 LGGs analisados (35). Finalmente, Jaber et al. encontraram, em 2016, na maior série até o momento, fluorescência visível em 13 (16%) dos 82 LGGs (36). Assim, de acordo com a literatura atual, a fluorescência visível é observada apenas em uma minoria de pacientes com LGGGs.

Estudo atual: 5-ALA Fluorescência em LGGG

Apesar desses outros estudos disponíveis na literatura atual, nossos dados mostraram a presença de fluorescência visível em mais da metade dos nossos casos durante a cirurgia. Uma possível explicação para a maior taxa de LGGs com fluorescência visível em comparação com a literatura atual pode ser que usamos uma dose ligeiramente maior de 5-ALA (25 mg/kg de peso corporal) em comparação com os outros estudos (18, 33, 34). Entretanto, Stummer et al. compararam diferentes doses de 5-ALA em cirurgia de glioma maligno (0,2, 2, 20 mg/kg) e concluíram que o uso de doses de 5-ALA superiores a 20 mg/kg de peso corporal provavelmente não resultaria em um efeito fluorescente melhorado (37). Outra explicação pode ser que incluímos também outras entidades tumorais além dos gliomas difusamente infiltrantes, como os astrocitomas pilocíticos ou um ganglioglioma. Nossos resultados promissores têm que ser confirmados, entretanto, em estudos multicêntricos independentes incluindo uma coorte maior de pacientes que sofrem de LGG.

Interessantemente, observamos fluorescência visível não apenas em áreas intratumorais focais como descrito anteriormente (33, 34), mas também fluorescência difusa com brilho homogêneo de todo o tumor. Assumimos que a presença de fluorescência visível focal no LGG pode representar áreas de potencial futura transformação maligna. Além disso, estudos futuros devem esclarecer se a extensão da ressecção poderia ser otimizada especialmente em LGGs com padrão de fluorescência difusa.

5-ALA Fluorescência e Histopatologia

Em nosso estudo, observamos níveis significativamente maiores de densidade celular e proliferação em amostras com fluorescência visível em comparação a nenhuma fluorescência. Isto está de acordo com os dois estudos anteriores de Widhalm et al (33, 34). Da mesma forma, Widhalm et al encontraram uma taxa mitótica, densidade celular e pleomorfismo nuclear significativamente maiores em amostras fluorescentes, em comparação com amostras não fluorescentes. Além disso, o índice de proliferação avaliado pelo MIB-1 LI foi significativamente maior em amostras com fluorescência visível, em comparação com amostras não fluorescentes. Neste sentido, estes dados anteriores indicam que a fluorescência visível é capaz de identificar focos anaplásicos de acordo com os critérios histopatológicos da OMS (33, 34). Como também encontramos uma densidade celular e uma taxa de proliferação significativamente maiores em áreas de fluorescência visível numa série de LGG, acreditamos que o 5-ALA pode servir como um marcador precoce da transformação maligna em curso de um LGG inicial. Estudos futuros com dados suficientes sobre o seguimento são necessários para esclarecer esta importante questão.

5-ALA Fluorescência e DEA

Atualmente, é prática comum para pacientes com LGG ter tratamento médico de convulsões epilépticas (38-40). Hefti et al. demonstraram em um estudo in-vitro que a síntese de PpIX foi reduzida em até 45% em células de glioma sob o efeito da fenitoína, mas não do levetiracetam (26). Em nosso estudo, constatamos que a fluorescência visível foi significativamente mais comum em pacientes sem DEA do que em pacientes com ingestão de DEA pré-operatória (r = 0,56; p = 0,045). Dos 15 pacientes com ingestão de DEA pré-operatória, 11 pacientes (73%) não mostraram fluorescência visível durante a ressecção. Em contraste, 10 (83%) dos 12 pacientes restantes sem ingestão prévia de DEA mostraram fluorescência visível. Os mecanismos subjacentes à influência observada dos DEA na fluorescência visível não estão claros até o momento. A influência dos DEA nas atividades de 5-aminolevulinic acid dehydrase e uroporphyrinogen I synthetase em eritrócitos de um rapaz epiléptico com deficiência de vitamina B6-deficiência em ácido valpróico e carbamazepina foi descrita também por Haust et al. da Universidade de Western Ontario, Canadá, em 1989 (41). Uma hipótese possível pode ser que os DEAs tenham influência nas enzimas da síntese de PpIX nas mitocôndrias das células gliomáticas e assim resultem na presença ou ausência de fluorescência no LGG. Um estudo adicional sobre as linhas celulares do glioblastoma revelou que os DEA (fenitoína/valprodutos) e a dexametasona podem inibir a síntese da PpIX (10). Os mecanismos exatos da influência dos DEA na fluorescência visível devem ser esclarecidos em estudos futuros.

Direções Futuras

No futuro, nossas primeiras observações devem ser confirmadas em outros estudos independentes com uma grande coorte de pacientes. Tais estudos maiores também permitem analisar a influência de diferentes tipos de DEA separadamente. Além disso, a influência dos DEA também deve ser investigada nos HGGs. Em casos com ausência de fluorescência visual, métodos de detecção quantitativa podem ser úteis para uma melhor visualização do tecido LGG. Nesse sentido, a microscopia confocal também é uma poderosa ferramenta para visualizar a fluorescência tumoral celular induzida por 5-ALA dentro dos LGGs e na interface cérebro-tumor (21). Entretanto, dados convincentes da microscopia confocal em uma grande coorte de pacientes com LGG ainda estão faltando até agora. Outro método representa a análise espectroscópica do acúmulo de PpIX com sondas específicas. Por esta abordagem, Valdes et al. descobriram que o acúmulo de PpIX pode ser detectado quantitativamente apesar da baixa precisão diagnóstica da fluorescência visual em LGG (35, 42). Conseqüentemente, essa abordagem promissora justifica investigações futuras.

Conclusões

No presente estudo, investigamos o papel do 5-ALA nos LGGs e a influência dos medicamentos antiepilépticos na fluorescência intra-operatória. De acordo com nossos dados, observamos uma taxa acentuadamente maior de fluorescência visível em nossa série de LGGs (52%), em comparação com a literatura atual. Além disso, foi observado um aumento da densidade e proliferação celular em áreas de fluorescência visível. Assim, a fluorescência induzida pelo 5-ALA pode também melhorar a visualização intra-operatória de um subgrupo de LGGs e pode também ser um marcador útil para a detecção otimizada da heterogeneidade histopatológica durante a cirurgia dos LGGs. Além disso, a ingestão pré-operatória de DEA parece reduzir a presença de fluorescência visível em tais tumores de acordo com nossos dados preliminares e, portanto, esta questão deve ser levada em conta no cenário clínico. Além disso, estudos multicêntricos independentes, incluindo uma coorte maior de pacientes com LGG, são necessários para confirmar os dados promissores deste estudo.

Limitações

Entendemos que a análise dos fatores que influenciam a Fluorescência deve ser multifacetada. Para isso, utilizamos o modelo de regressão logística. O DEA provou ser um fator significativo influenciando a probabilidade de fluorescência intra-operatória, quando ajustado para outros potenciais confundidores (astrocitoma/não-astrocitoma, localização frontal, dose de dexametasona, mutação IDH1) em um modelo de regressão logística. A densidade celular e o índice Ki67 foram revelados apenas em pacientes com biópsias múltiplas (10 pacientes). Concluiu-se que a densidade celular e o índice Ki67 foram maiores para as amostras de biópsia retiradas da zona fluorescente do que para as não fluorescentes. Temos poucas evidências sobre a densidade celular para os demais 17 pacientes, com seu índice Ki67 compondo principalmente 4-5%. Como se trata de uma análise retrospectiva que inclui 27 pacientes, não planejamos estudar a densidade celular e o índice Ki67. Infelizmente, não temos um conjunto completo de dados para o Ki67 e densidade celular para incluir em um modelo de regressão logística.

Ethics Statement

Este estudo foi realizado pelo comitê local do N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Moscou, Rússia) com consentimento informado por escrito de todos os sujeitos. Todos os sujeitos deram o consentimento informado por escrito de acordo com a Declaração de Helsinque. O protocolo foi aprovado pelo comitê local do N. N. Burdenko National Medical Research Center of Neurosurgery (Moscow, Russia).

Author Contributions

SG, GW, e AP projetaram o estudo. LS, VJ, e MR coletaram a data. TS, VL, GP, e AR trabalharam os detalhes técnicos. MG e DC analisaram os dados e escreveram o trabalho com a contribuição de todos os autores. AS e AP editaram o texto. KC analisou os dados e escreveu o trabalho com a entrada de todos os autores.

Funding

O estudo relatado foi financiado por RFBR de acordo com os projetos de pesquisa No. 17-00-00158, No.17-00-00159, e 17-00-00157 .

Conflict of Interest Statement

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Desejamos agradecer a ajuda prestada pelos nossos colegas: Danilov G. V., MD, Ph.D., N. N. Burdenko Scientific Research Neurosurgery Institute, Moscow, Russia para suporte estatístico.