O uso de polímero de polietilenoimina em cultura celular como fator de fixação e lipofeccionador

PEI promove a fixação de células de fraca fixação e tecidos primários

CélulasPC-12 são usadas como modelo de diferenciação neuronal em laboratório, como tratamento destas células com fator de crescimento nervoso (NGF) induz a extensão neurite e a expressão de marcadores bioquímicos do simpático fenótipo neuronal. Eles crescem como células de fraca ancoragem e polímeros de colágeno ou polisina são frequentemente utilizados para placas de pré-cobertura para cultura de células PC-12 . As células PC-12 foram cultivadas em laboratório em poços ingénuos ou em poços pré-cobertos com diversos factores de fixação (pratos de cultura de tecidos multipoços-12), para observar o efeito na ancoragem das células ao substrato. Na ausência de qualquer agente de revestimento, as células mostraram uma tendência característica para formar grupos de células que se acumulam em direção ao centro do poço; estas células estão firmemente presas entre si, mas muito fracamente presas ao prato de cultura de tecidos (Figura 1D). Isto resulta em uma distribuição muito heterogênea das células (muito poucas células permanecem em direção à borda dos poços) e perda significativa de células durante os procedimentos de lavagem ou mudanças de meio. O pré-tratamento das placas com PEI resultou numa distribuição significativamente mais homogénea das células no poço, com as células ligadas à placa firmemente, mostrando uma tendência muito menor para a agregação (Figura 1A). Para comparação, as placas também foram pré-tratadas com outros agentes de revestimento comumente usados, colágeno (Figura 1B) e poli-D-Lisina (PDL; Figura 1C), resultando também em uma fixação mais firme das células nas placas e uma distribuição mais homogênea das células.

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Para testar ainda mais a propriedade de realce de ancoragem observada com o pré-tratamento PEI dos pratos de cultura, foi utilizado um segundo sistema. Explantes de retina de peixes teleost têm sido utilizados no estudo da regeneração nervosa . Quando uma lesão é aplicada ao nervo óptico dos peixes, é iniciada uma resposta de regeneração e as células ganglionares da retina (RGCs) da retina re-extendem o seu axônio em direção ao tecido alvo tectal. Se a retina de um peixe tão “primado” é explantada e cultivada, a resposta de regeneração é observada in vitro através da extensão acelerada de neurites longas. No entanto, este fenómeno requer o uso de matriz extracelular ou factores de fixação (por exemplo colagénio ou revestimento PDL), uma vez que os explantes mostram uma afinidade muito baixa com a superfície plástica não revestida. Foram realizadas experiências para observar se o PEI poderia atuar como um fator de fixação propício ao crescimento axonal dos explantes de retina zebrafish. Os explantes de retina dos olhos de zebrafish de controle foram capazes de se fixar em pratos de cultura pré-tratados pela PEI (Figura 1E). Além disso, os explantes de retina de peixes que receberam uma lesão condicionante foram capazes de estender vigorosamente os axônios quando cultivados usando PEI como fator de fixação (Figura 1F).

Os resultados com os explantes de retina sugeriram que as células neuronais ligadas a pratos revestidos com PEI podem se diferenciar, gerando neurites que se fixam bem ao substrato. Para testar esta hipótese com as células PC-12 pró-neuronais, experimentos de diferenciação pelo tratamento com NGF foram realizados com células ligadas a pratos revestidos com PEI. As células PC-12 tratadas com NGF permaneceram firmemente presas à placa durante vários dias, gerando redes de neurônios (Figura 2). Os resultados indicam que o PEI é permissivo para o processo de diferenciação e para a fixação das neurites no prato. As células diferenciadas permaneceram firmemente ancoradas através de experimentos de imunocitoquímica (M. Challa, G. R. Chapa, M. González-García e R. P. Ballestero, resultados inéditos).

Força de ancoragem de células eucarióticas para cultura de pratos pré-tratados com PEI e outros factores de ancoragem

Tres linhas celulares diferentes foram seleccionadas para testar a capacidade da PEI em promover uma forte ancoragem em pratos de cultura de plástico. As células PC-12 e HEK-293 foram descritas acima como ancoragem fraca. Por outro lado, as células MYS são fibroblastos primários que aderem fortemente aos pratos de cultura de plástico, crescendo para formar uma monocamada de células na superfície. Para testar a força de ancoragem das diversas células às placas, foi realizado um protocolo no qual foram realizadas 4 lavagens consecutivas com tampão isotônico, seguidas do uso de um protocolo colorimétrico para a contagem das células que permaneceram na placa (com base no corante vital vermelho neutro). As placas pré-tratadas com os diversos fatores de fixação foram comparadas com as placas que não receberam pré-tratamento (não tratadas). As experiências foram realizadas em triplicata, e as médias de corante retido nas placas que receberam cada tratamento foram calculadas. Essas médias foram normalizadas para a média obtida com o pré-tratamento PEI, ao qual foi atribuído o valor arbitrário de 100,0% em todos os experimentos. Os resultados dos experimentos representativos com as 3 linhas celulares são mostrados na Figura 3 (pelo menos três experimentos independentes foram realizados com cada linha celular). As células PC-12 fixadas quase igualmente bem em placas revestidas com PEI, colágeno ou PDL (contagem relativa de células de 100,0% ± 5,3%, 89,3% ± 5,0% e 96,3% ± 5,8%, para PEI, colágeno e PDL respectivamente). No entanto, observou-se uma perda significativa de células ao comparar placas não tratadas com placas pré-tratadas com PEI, com uma contagem relativa de células de 43,9% ± 5,8% (Figura 3A). No caso do HEK-293, as células se ligaram fortemente aos poços tratados com PEI e PDL. No experimento representativo mostrado na Figura 3B, a contagem relativa com esses dois tratamentos foi de 100,0% ± 0,4% e 96,8% ± 1,7%, respectivamente. No entanto, um grande número de células foi perdido quando tratadas nos poços não tratados (contagem relativa de 8,3% ± 0,6%), ou nos poços que foram pré-tratados com colágeno (11,5% ± 1,2%), sugerindo que estas células se ligam de forma bastante solta aos poços de plástico ou revestidos com colágeno. Finalmente, quando as células fibroblásticas (células MYS) foram utilizadas, as células pareciam fixar-se bastante bem às quatro superfícies, incluindo aos poços não tratados (Figura 3C). A Figura 3C mostra um gráfico representativo, mostrando a contagem relativa de células MYS de 100,0% ± 2,2%, 85,9% ± 7,8%, 73,7% ± 6,6% e 77,1% ± 1,4%, com poços pré-tratados com PEI, colágeno ou PDL, ou poços não tratados, respectivamente. Esta linha de células, portanto, se fixa bastante bem à superfície plástica não tratada comparativamente às linhas de células PC-12 e HEK-293.

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Para fornecer uma indicação da variação entre os experimentos, as médias ± desvios padrão das contagens relativas de células obtidas nos experimentos independentes foram calculadas para cada linha de células e tratamento (note que como em todos os experimentos a contagem para poços pré-tratados com PEI foi definida em 100,0%, o valor para a média global com este agente de revestimento é exatamente 100,0% para todas as linhas de células). Os resultados comparativos para os outros tratamentos estão indicados abaixo. Para as células PC-12, as contagens relativas foram 81,5% ± 8,8% para os poços tratados com colágeno (n = 4), 93,9% ± 21,2% para os poços tratados com PDL (n = 4), e 52,1% ± 13,7% para os poços não tratados (n = 4). Para as células HEK-293, as contagens relativas foram 16,3% ± 12,7% para poços tratados com colágeno (n = 3), 99,6% ± 2,5% para poços tratados com PDL (n = 3), e 9,0% ± 4,1% para poços não tratados (n = 3). Nas experiências com células MYS, a média das contagens relativas com poços previamente tratados com colagénio foi 92,7% ± 16,2% (n = 3), 71,1% ± 6,7% para poços previamente tratados com PDL (n = 3), e 78,4% ± 11,5% para poços não tratados (n = 3). A análise estatística indica que o aumento da aderência das células PC-12 e HEK-293 a pratos pré-tratados PEI versus plástico não tratado é significativo (p < 0,05 e p < 0,01 respectivamente, análise de teste t), enquanto não é estatisticamente significativo para células MYS (p > 0,05).

Para caracterizar ainda mais as propriedades do PEI como fator de fixação para células de fraca fixação, foram realizados experimentos para analisar a dosagem do PEI que pode fornecer fixação celular ideal, a faixa de números de células que podem se beneficiar da presença do PEI, e a estabilidade do PEI como fator de fixação. A Figura 4A mostra os resultados de um experimento representativo testando a força de fixação de células HEK-293 em pratos revestidos com várias doses de PEI. As contagens de células foram normalizadas para o valor obtido para o tratamento com 25 μg/ml de PEI, que foi fixado em 100,0%. Os resultados indicam que concentrações de PEI de 2,5 μg/ml ou superior resultaram em aumento máximo de fixação, sugerindo que a superfície do prato plástico é totalmente revestida com o polímero nestas concentrações. As concentrações mais elevadas do polímero não parecem ter efeitos tóxicos sobre as células se o excesso de PEI remanescente na solução for removido completamente (foram observados ligeiros efeitos tóxicos na concentração de 250 μg/ml se a solução não for totalmente removida após o tratamento). O experimento mostrado é representativo de 4 experimentos independentes. A Figura 4B representa os resultados obtidos com vários números de células PC-12 e HEK-293. A figura mostra a contagem relativa de células, onde um valor arbitrário de 100,0% foi atribuído à contagem média obtida a partir dos poços tratados com PEI com o maior número de cada linha de células (3,2 × 105 células HEK-293 e 1,5 × 106 células PC-12). Os resultados indicam que o PEI funcionou bem como um fator de fixação sobre uma ampla gama de números de células tanto para as células PC-12 como HEK-293. Números de células inferiores não puderam ser testados de forma confiável porque estavam próximos do limite de sensibilidade do ensaio vermelho neutro. Os resultados mostrados são representativos de pelo menos 4 experiências independentes realizadas com cada linha de células. A Figura 4C mostra os resultados de um experimento realizado para testar a estabilidade do PEI como fator de fixação. Neste experimento, um conjunto de placas foi tratado com PEI e depois mantido em PBS a 4°C por 10 dias. Em um segundo teste, as placas foram tratadas com PEI e mantidas (com meio) na incubadora de CO2 a 37°C por 3 dias, com uma mudança média realizada a cada 24 h. O desempenho do PEI nessas placas foi então comparado com placas tratadas com PEI usando o protocolo padrão descrito para experimentos anteriores. Os resultados mostram contagens relativas de células normalizadas para a média das absorvâncias obtidas com as placas tratadas com PEI padrão, que foi dado o valor arbitrário de 100,0%. Os resultados indicam que o revestimento do PEI permanece estável na superfície da placa plástica por pelo menos 10 dias de refrigeração e que não é removido por incubação a 37°C em meio ou mesmo por mudanças repetidas do meio. Os resultados são representativos de 4 experimentos independentes realizados em triplicata.

PÉI pré-tratamento melhora a lipofecção das células de fraca ancoragem

Transfecção de células eucarióticas por lipofecção envolve várias etapas, adições e substituições de meios, que podem ter um custo em células de fraca ancoragem. Mesmo que se tenha o cuidado de evitar a perda de células, as células pouco ancoradas podem ser menos eficientes na absorção dos complexos transfectantes. Como o pré-tratamento PEI de pratos de cultura celular aumentou a força de fixação das células a tais superfícies, foi levantada a hipótese de que o fator de fixação pode ter um efeito positivo no rendimento transfeccional obtido por lipofecção. As três linhas celulares descritas acima foram utilizadas para testar esta hipótese, utilizando os agentes de revestimento previamente examinados. As transfecções foram realizadas com um plasmídeo codificando a enzima repórter β-galactosidase. O rendimento da transfecção foi monitorado pela determinação da atividade da enzima repórter nos lisados a partir das células transfectadas. Pelo menos dois ensaios independentes em triplicata foram realizados com cada linha celular. Os gráficos representativos são mostrados na Figura 5. Os rendimentos (β-galactosidase) foram normalizados para a atividade obtida com a pré-camada PEI, que foi fixada como referência em 100,0%. Em geral, observou-se que os rendimentos da transfecção foram melhorados nas células de fraca ancoragem através do pré-revestimento com agentes que promovem a fixação celular à placa. No caso das células PC-12, o pré-revestimento dos poços com PEI, colágeno ou PDL resultou em um aumento de 2 a 3 vezes do rendimento transfeccional relacionado aos poços não tratados: rendimentos relativos de 100,0% ± 1,4% para PEI, 87,0% ± 8,7% para colágeno e 100,1% ± 2,4% para PDL, contra 42,9% ± 2,2% para os poços não tratados (Figura 5A). A melhoria do rendimento da transfecção pelo pré-tratamento PEI foi mais pronunciada para as células HEK-293. A experiência na Figura 5B mostra uma atividade relativa de 21,1% ± 3,4% para as células nos poços não tratados, quando comparada com 100,0% ± 8,4% para os poços pré-tratados com PEI (aumento de aproximadamente 5 vezes). O pré-tratamento com colágeno ou PDL resultou em induções mais modestas (aproximadamente 2 a 3 vezes mais na Figura 5B). A menor melhora foi observada com colágeno, similar ao menor realce de fixação das células HEK-293 que foi observado anteriormente na Figura 3B. Finalmente, para os fibroblastos MYS fortemente fixados, não houve um efeito positivo significativo observado pelo uso de fatores de fixação no procedimento de transfecção. As variações foram geralmente inferiores a 20% para todas as condições experimentais. O experimento representativo mostrado na Figura 5C, de fato, mostra um rendimento de transfecção ligeiramente maior para os poços não tratados do que para as placas pré-tratadas PEI (atividade relativa de 117,7% ± 3,2% para os poços não tratados versus 100,0% ± 4.8% para os poços pré-tratados com PEI, ou aproximadamente 1,2 vezes maior rendimento transfeccional no controle).