A doença coronavírus 2019 (COVID-19) é uma doença infecciosa que causou uma pandemia global com mais de 36 milhões de pessoas infectadas de cerca de 200 países ou territórios, com mais de 1 milhão de mortes até à data (Organização Mundial de Saúde (OMS), 2020). O agente causador da COVID-19, o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SRA-CoV-2), é assumido como sendo originário de morcegos, uma vez que o coronavírus RaTG13 transmitido por morcegos é o parente genético mais próximo até à data (Andersen et al., 2020; Zhou et al., 2020). Várias espécies têm sido estudadas para determinar seu papel potencial como hospedeiros intermediários (Shi et al., 2020). Além disso, modelos animais para recapitular uma doença do tipo COVID-19 são considerados uma importante linha de pesquisa e necessários para o desenvolvimento de drogas terapêuticas e compostos profiláticos.
Beside vários estudos de modelação propondo espécies animais potenciais susceptíveis à SRA-CoV-2 (Damas et al., 2020; Qiu et al., 2020; Veljkovic et al., 2020), múltiplas infecções experimentais já mostraram uma vasta gama de animais susceptíveis. Especificamente, morcegos frugívoros egípcios, furões, hamsters sírios dourados, gatos, ratos que expressam a enzima humanizada de conversão de angiotensina 2 (ACE2), ratos BALB/c (usando uma mutação do SRA-CoV-2 por várias passagens de cultura celular) e algumas espécies de primatas não humanos são permissivas à infecção viral, desenvolvendo desde doença respiratória subclínica a doença respiratória leve a moderada (Bao et al.., 2020; Halfmann et al., 2020; Kim et al., 2020; Rockx et al., 2020; Shi et al., 2020; Yu et al., 2020). De um ponto de vista experimental, a susceptibilidade dos cães à SRA-CoV-2 é limitada, uma vez que os animais inoculados podem ser parcialmente seroconvertidos (Shi et al., 2020). Em contraste, a inoculação intranasal de galinha, pato e porco resultou em nenhuma evidência de infecção (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020).
Porco é comumente usado em pesquisas devido às semelhanças existentes com humanos em termos de anatomia, genética, fisiologia e, também, imunologia. De facto, as experiências em suínos são provavelmente mais preditivas de tratamentos terapêuticos e preventivos em humanos do que as experiências em roedores (Meurens et al., 2012). No entanto, uma vez que os porcos não são susceptíveis à infecção por SRA-CoV-2 quando inoculados intranasalmente (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), a possibilidade de desenvolver um modelo de infecção suína com este vírus utilizando outras potenciais vias de inoculação merece ser investigada. A principal razão para testar porcos é que o receptor ACE2 desta espécie é funcional através da transfecção de ACE2 em células de HeLa (que não expressam constitutivamente a ACE2 humana) (Zhou et al., 2020) ou que as pseudopartículas com a proteína S da SRA-CoV-2 são capazes de infectar células renais de suínos (Letko et al., 2020). Além disso, a proteína ACE2 é expressa em todos os principais tecidos dos suínos, tal como avaliado pela imunohistoquímica (Xiao et al., 2020). Em consequência, para estabelecer um putativo modelo de porco COVID-19, investigámos o efeito de diferentes vias naturais e não naturais de inoculação da SRA-CoV-2 em porcos domésticos (Sus scrofa domesticus).
Para o efeito, foram seleccionados quatro grupos de cinco leitões convencionais de 5 a 6 semanas (Landrace × Large White) e inoculados através de diferentes vias: intranasal (IN, 1,5 ml/nostril; volume total de 3 ml), intratracheal (IT, 3 ml) como descrito anteriormente (Garcia-Morante et al, 2016), intramuscular (IM, 1 ml em cada lado dos músculos do pescoço; volume total de 2 ml) ou intravenosa (IV, 2 ml), com uma dose final de 105,8 dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID50) do isolado da SRA-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_510689) por cada animal. Os grupos IT e IV foram anestesiados com 10 mg/kg de quetamina e 0,8 mg/kg de xilazina antes da inoculação. Uma passagem -2 SRA-CoV-2 foi propagada e titulada em células Vero E6 (ATCC CRL-1586), seguindo o mesmo protocolo que para outros coronavírus (Rodon et al., 2019). Foram utilizados dois porcos extra como controlos negativos.
Todos os animais foram seropositivos contra o coronavírus respiratório suíno, conforme determinado por um ELISA comercial (INgezim Corona Diferencial 2.0 ). Tendo em conta que não foi descrita a reactividade cruzada de anticorpos entre alfa- e beta-coronavírus (Okba et al., 2020), os animais foram mantidos no estudo. A reatividade inicial contra PRCV era esperada já que este vírus é onipresente no gado suíno europeu (Saif et al., 2012; Vidal et al., 2019).
As experiências anímicas foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Bem-Estar Animal do Instituto de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (CEEA-IRTA) e pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Governo Autônomo da Catalunha e conduzidas por pessoal certificado. As experiências com a SRA-CoV-2 foram realizadas nas instalações do Biosafety Level-3 (BSL-3) da Unidade de Biocontenção do IRTA-CReSA (Barcelona, Espanha).
Em 2 e 22 dias pós-inoculação (dpi), dois e três animais/grupo (IT, IM e IV), respectivamente, foram eutanizados. Uma vez que a inoculação IN já foi demonstrada como não eficaz para causar infecção pelo SRA-CoV-2 (Shi et al., 2020), os suínos inoculados por esta via foram eutanizados nos dias 1 e 2 pi para avaliar evidências de uma possível infecção transitória precoce nos tecidos. Os animais de controlo negativo foram eutanizados antes do início da experiência. As amostras foram coletadas e processadas conforme descrito anteriormente (Vergara-Alert et al., 2017). Brevemente, necropsias completas foram realizadas em todos os animais. Vários tecidos (turbinados frontal, medial e caudal; traquéia proximal, medial e distal; brônquios grande e pequeno, áreas cranial, mediodorsal e pulmonar caudal; rim; fígado; coração; e baço) foram colhidos, fixados por imersão em formalina 10% neutra, embebidos em parafina e seccionados em 3 µm para preparar as lâminas. Lâminas preparadas para histologia foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) para avaliar potenciais lesões microscópicas. Além disso, os mesmos tecidos mais íleo, linfonodo cervical (LN), LN mediastinal, LN mesentérico, bulbo olfativo, tonsila, timo, glândula salivar parotídea, adrenal, pâncreas, tronco cerebral, pálpebras e medula óssea também foram tomados no meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) em tubos com contas para realizar a detecção do gene SARS-CoV-2 upE por RT-qPCR (Corman et al., 2020). Foram também realizadas zaragatoas nasais e rectais (diariamente durante a primeira semana e às 14 e 22 dpi) para análise da presença de RNA viral através do RT-qPCR acima mencionado. As amostras de soro colhidas nos dias 0, 14 e 22 pi foram testadas para a presença de anticorpos contra o espigão SRA-CoV-2 S1 + S2 e proteínas nucleocapsid (N) por ELISAs (Institut de Recerca de la sida (Irsicaixa), 2020). Também foi realizado um ensaio de neutralização do vírus seguindo um protocolo anterior com uma pequena modificação (Rodon et al., 2020), as diluições em série de soros e SRA-CoV-2 foram incubadas durante 1 hora a 37ºC antes da realização do ensaio em placas.
Todos os animais foram monitorizados diariamente mas nenhum deles apresentou sinais clínicos após a inoculação do SRA-CoV-2. Também, não foram encontradas lesões brutas ou microscópicas atribuíveis à infecção pelo SRA-CoV-2 em nenhum dos animais estudados de todos os grupos de inoculação, bem como nos animais de controlo (dados não apresentados).
Nenhum dos porcos apresentava descamação nasal ou rectal do RNA viral. A traquéia proximal de um animal inoculado com IN foi positiva a 1 dpi para RNA viral (Cq = 24,36). Os tecidos restantes deste animal e do resto dos suínos resultaram negativos para RT-qPCR (limite de detecção qPCR de 38,6 ciclos).
Por 14 e 22 dpi, baixos níveis de anticorpos direcionados contra a proteína Spike puderam ser detectados em todos os animais dos grupos IM e IV (Figura 1a). Além disso, estes suínos também apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes a 22 dpi (variando de 74 a 317 SNT50 título de diluição recíproca) (Figura 1b). Também, níveis baixos de anticorpos visando a proteína N foram encontrados em um dos três MI e em todos os animais inoculados IV até o final do experimento (dados não mostrados). Importante, um único animal do grupo IT não mostrou anticorpos contra a proteína S, mas tinha anticorpos contra a proteína N, bem como títulos neutralizantes (título de diluição recíproca SNT50 de 29) no dia 0 pi, o que pode sugerir uma potencial reação cruzada com outro vírus corona infectando suínos. De notar que estes anticorpos contra a proteína N diminuíram quando a experiência terminou, o que sugere que eram de origem materna. Além disso, este animal não apresentou anticorpos seroneutralizantes aos 22 dpi (Figura 1b).
Os dados actuais indicam que a SRA-CoV-2 não foi capaz de infectar suínos por nenhuma das vias testadas, nomeadamente IN, IT, IM e IV. Portanto, os nossos esforços confirmam experiências anteriores que indicam a falta de susceptibilidade de infecção pelo porco (Schlottau et al., 2020; Shi et al., 2020), embora possa ser usada para avaliar a imunogenicidade dos próximos candidatos à vacina.
Importante, o estudo actual vai além de outros estudos com SRA-CoV-2 e com porcos, uma vez que testamos um número mais alargado de vias de inoculação. No entanto, nenhuma delas resultou numa infecção produtiva em leitões. Um resultado significativo deste estudo foi a evidência de seroconversão contra a glicoproteína Spike nos dias 14 e 22 pi e presença de anticorpos neutralizantes no dia 22 pi em leitões inoculados por vias parenterais (IM e IV). Considerando a curta duração da experiência (22 dias), tal seroconversão enfatiza o potencial interesse do porco em ser utilizado em estudos de imunogenicidade para a SRA-CoV-2. De facto, o interesse dos suínos como modelo animal adequado para imunologia, bem como fisiologia, farmacologia e cirurgia, aplicável à medicina humana é amplamente reconhecido (Rothkötter, 2009).
Em conclusão, o presente estudo confirma que os leitões não são um modelo animal adequado para a COVID-19, mas sua potencial utilidade como modelo de imunogenicidade em estudos de desenvolvimento de vacinas pré-clínicas merece mais investigação.