Novas técnicas de isolamento de microrganismos com ênfase na impressão a laser | CDhistory

Novos métodos de isolamento

Agora, uma grande variedade de métodos é usada para expor novos microrganismos, anteriormente não cultivados. Em particular, são utilizados novos meios nutritivos contendo substâncias específicas; o cultivo é realizado sob diferentes condições físicas e químicas do ambiente, tais como composição atmosférica, temperatura e pH. Além disso, foram estudadas aplicações de meios nutritivos diluídos em combinação com longos períodos de incubação, assim como o cultivo conjunto de microrganismos de diferentes espécies. Nos últimos anos, alguns métodos fundamentalmente novos de cultivo baseados na colocação de microorganismos no ambiente natural sem o uso de meios nutritivos têm sido desenvolvidos. Tais métodos utilizam câmaras de difusão e revestimentos de polímeros nos quais as células microbianas são colocadas. Neste caso, os microrganismos recebem todos os nutrientes necessários do ambiente natural, permanecendo isolados dele. A alocação de um novo produtor de antibióticos (teixobactin) usando tais métodos é considerada como uma conquista importante. Outra abordagem inclui o cultivo e rastreio simultâneo de dezenas e centenas de milhares de microcolónias bacterianas em lascas de polímero poroso ou isolamentos cerâmicos. Para o cultivo de microorganismos “inculturáveis”, também podem ser utilizados métodos que permitam o isolamento de células únicas de ambientes naturais. Entre estes métodos, o mais popular é baseado na diluição da suspensão de microrganismos, citometria de fluxo e separação de células, microdissecção a laser, compartimentação e aplicação de micromanipuladores. Além do cultivo de espécies de microrganismos anteriormente não cultivadas, o isolamento de células microbianas únicas é necessário para o estudo da fisiologia celular, interações entre células, bem como para a busca de novos metabólitos, como antibióticos e enzimas.

O progresso científico e tecnológico moderno oferece muitas oportunidades em termos do desenvolvimento de novos métodos de cultivo, isolamento, manipulação e estudo de células bacterianas individuais e seus consórcios. Novas abordagens podem acelerar significativamente o processo de trabalho com microorganismos e permitir a realização de seus estudos mais completos e abrangentes. É necessário notar que até agora muito poucos métodos foram propostos para o posicionamento de matrizes bacterianas com precisão micrométrica. Em Akselrod et al., redes tridimensionais (3D) de células vivas em hidrogel foram formadas sem perda da sua viabilidade utilizando matrizes de armadilhas ópticas holográficas multiplexadas (pinças) com precisão sem precedentes (<400 nm). Para formar armadilhas ópticas, foram utilizados dois lasers: laser Ar+ (20 W, comprimento de onda de 514 nm) e onda contínua Ti: laser safira, sintonizável na faixa de λ = 850-900 nm, bem como uma combinação de dois elementos difrativos, combinados com diferentes lentes em um microscópio óptico invertido. Foram formadas redes de fibroblastos 3T3 rodeadas por um anel de bactérias. Foi também demonstrada a capacidade de manipular centenas de bactérias Pseudomonas aeruginosa simultaneamente em arrays bidimensionais (2D) e 3D. O método de armadilhagem óptica holográfica é muito preciso, mas tecnicamente difícil de realizar.

No estudo de Rowan et al., é proposto o método de funcionalização heterogênea de superfícies, que é um processo litográfico de quatro etapas baseado na impressão por microcontacto de monocamadas orgânicas, implantação de polímero hiperbranqueado, e sua posterior funcionalização. Como resultado, são obtidas estruturas sobre as quais é feita a inoculação dirigida de células bacterianas. As investigações de sobrevivência celular mostraram que as células permanecem viáveis nas superfícies estruturadas obtidas. Foram obtidos grandes isolados de bactérias contendo 18 ± 5 bactérias e pequenos isolados contendo 2 ± 1 bactérias. De acordo com este trabalho, o método demonstrado pode ser usado para triagem e biosensagem de alto rendimento. Entretanto, é difícil combinar a funcionalização heterogênea das superfícies usando este método com a pesquisa biológica de rotina e condições de cultivo de microorganismos (temperatura, pH, nutrientes, etc.). É necessário notar que a tarefa de encontrar formas simples de fornecer a alta resolução de matrizes de bactérias vivas com a oportunidade de vários estudos biológicos foi resolvida em algumas publicações. As abordagens propostas nestes trabalhos são, de facto, os presságios da impressão 3D.

Num estudo de Weibel et al., foi proposta a técnica da estampagem de bactérias vivas em placas de agarose. Foram impressas matrizes de bactérias (o tamanho de um único ponto com bactérias >200 µm) na área de até 50 cm2. Carimbos de polidimetilsiloxano (PDMS) foram produzidos com a ajuda da técnica de fotolitografia. O tamanho mínimo alcançado da protrusão da impressão foi de 190 µm à altura de 140 µm, que, no entanto, está longe do tamanho necessário para separar as bactérias. Este método é rápido, reprodutível e conveniente e pode ser usado para controlar o padrão, espaçamento e orientação entre colônias de diferentes bactérias. No estudo de Xu et al., matrizes de bactérias vivas com resolução celular foram impressas em substrato de agarose usando carimbos elastoméricos (PDMS) com alta relação de aspecto, obtidos pelo método de litografia in situ inversa (RISL). A Figura 1 mostra as vantagens do método RISL sobre a fotolitografia padrão ultravioleta. A única limitação da tecnologia RISL é o diâmetro de protrusão, que dificilmente pode ser <1 µm, devido ao limite de difração óptica.

O método de impressão de matrizes de bactérias por microcontacto funciona da seguinte forma: A gota de Escherichia coli no meio de cultura LB é depositada em gel de agarose (3 % de peso em LB) e, sobre o substrato de agarose, forma-se uma monocamada de bactérias (o líquido é absorvido pelo gel de agarose). Em seguida, o PDMS carimba os contatos com uma monocamada de bactérias que cobre o gel de agarose. O carimbo é retirado e a parte da bactéria permanece sobre ele. Então, no contacto do carimbo com a camada de gel de agarose (4 wt% em LB, espessura 200 µm), as bactérias são transferidas para a camada de agarose. Assim, em poucos segundos, matrizes de bactérias E. coli podem ser impressas diretamente sobre o substrato de agarose com resolução em mícrons, até uma única bactéria, em uma grande área (cm2). Foi demonstrado que, após a impressão do padrão, as bactérias continuam a crescer e a dividir-se, como nas condições de cultura em massa, ou seja, as bactérias mantêm o seu comportamento fisiológico normal após a impressão. Foi também demonstrado que a concentração de agarose é crucial para o bom desempenho da impressão. Uma concentração muito baixa leva a uma distorção do padrão impresso, enquanto que uma concentração muito alta não é adequada para o cultivo de bactérias. Para obter matrizes de bactérias únicas, foi estudado o efeito da redução da concentração inicial de bactérias em uma gota do meio de cultura LB. Para as concentrações iniciais de 109 e 108 células/ml, o número médio de bactérias por mancha foi medido em 12,1 e 1,4, respectivamente. Uma distribuição muito estreita foi obtida com a baixa concentração de bactérias: 44,6% das manchas tinham apenas uma célula de E. coli e 40,1% das manchas tinham 0 ou 2 células. Estes resultados demonstraram que a impressão por microcontacto permite a produção de matrizes regulares de uma única bactéria. Além disso, foi demonstrado que esta abordagem à separação das matrizes bacterianas permite analisar as taxas de crescimento de linhas individuais de bactérias. Esta metodologia fornece uma forma simples para qualquer distribuição espacial 2D de bactérias desejada e pode ser usada tanto para triagem quanto para estudos de variação fenotípica bacteriana, dinâmica populacional e evolução dos ecossistemas.

Uma área de rápido desenvolvimento – a sociomicrobiologia – identificou os mecanismos com a ajuda dos quais as bactérias participam de relações colaborativas e competitivas influenciando os vizinhos próximos através do contato físico e da modificação da composição química do seu microambiente comum. Para explorar o comportamento de pequenos agregados microbianos, foram desenvolvidas diferentes tecnologias de microprocessamento que limitam as bactérias em dispositivos microfluídicos, microresonadores e gotículas líquidas de volume ultra-baixo. A capacidade de integrar sistemas analíticos com microfluidos tornou essas plataformas de isolamento atraentes para a triagem de alto desempenho para análise de resistência a antibióticos e de atividade enzimática. Por exemplo, em Eun et al., uma análise de alto desempenho e isolamento de células bacterianas encapsuladas em micropartículas de agarose com o uso de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) são descritas. Foram utilizados sistemas de microfluidos com foco no fluxo para criar micropartículas monodispersivas com um diâmetro de ≈30 µm. Os tamanhos destas partículas tornaram-nas compatíveis com a citometria de fluxo e FACS, e a sensibilidade destes métodos reduziu o tempo de incubação para replicação celular antes da realização das análises. O pequeno volume de micropartículas (≈1-50 picolitro ) minimizou o número de reagentes necessários para os estudos bacterianos. Esta plataforma permitiu alocar e isolar eficazmente as bactérias, assim como utilizar a combinação de métodos para a rápida identificação de alvos para pequenas moléculas biologicamente activas. Como demonstração experimental deste método, as células de E. coli foram encapsuladas em micropartículas de agarose, incubadas na presença de diferentes concentrações de rifampicina, e analisadas com o uso de FACS. A concentração inibitória mínima de rifampicina foi determinada e mutantes espontâneos que apresentavam resistência aos antibióticos foram isolados com a ajuda da FACS e caracterizados pelo sequenciamento do DNA. Usando esta abordagem, o tempo e a quantidade de antibióticos necessários para isolar os mutantes foram reduzidos em 8 e 150 vezes, respectivamente, em comparação com os métodos microbiológicos tradicionais usando placas de ágar nutriente. Assim, este método é importante nos campos da biologia química, química de produtos naturais, bem como para a descoberta e caracterização de metabolitos secundários biologicamente ativos.

As abordagens mencionadas acima foram úteis para limitar o tamanho, forma e atributos físicos (microhabitat); entretanto, nenhuma delas proporcionou a oportunidade de determinar arbitrariamente a geometria 3D dos agregados bacterianos ou a orientação de múltiplas populações. Além disso, o processo de encapsulamento celular em cavidades de volume ultra-baixo frequentemente limita o transporte de massa, levando a condições incompatíveis com o crescimento e a sinalização entre populações fisicamente isoladas. Um número crescente de provas evidencia a importância das microcolônias na reprodução bacteriana; no entanto, observa-se a falta de ferramentas para avaliação sistemática do comportamento celular em tais comunidades. Novas estratégias para a criação de um ambiente cultural 3D em escala microscópica podem desempenhar um papel crucial na identificação de como as bactérias gerenciam a resistência aos antibióticos e outros comportamentos sociais em pequenos agregados densos.

Em Connell et al. e Connell et al., é descrito o método de formação a laser de câmaras microscópicas 3D baseadas na litografia multifótona-litografia (MPL). O método MPL tem alta capacidade de produção e a capacidade de produzir padrões arbitrários. Ele oferece oportunidades para a produção industrial de microdispositivos 3D, tais como componentes micro-ópticos, andaimes para engenharia de tecidos e chips microfluídicos. No estudo de Connell et al., a albumina de soro bovino (BSA), uma proteína altamente solúvel que pode ser reticulada em hidrogéis porosos, duráveis e biocompatíveis, foi utilizada para criar câmaras bacterianas 3D microscópicas. Algumas bactérias separadas foram encerradas nas câmaras de BSA com o volume de 1 pl e foram depois cultivadas em populações clonais. Devido à difusão de moléculas biologicamente significativas e antibióticos através das paredes da BSA, bem como à troca de sinais sensíveis ao quórum, foi estudado o comportamento social das comunidades bacterianas em relação ao tamanho e densidade da população, a forma do recipiente e a taxa de fluxo do ambiente.

Com o corpo humano, as bactérias geralmente existem em comunidades 3D estruturadas constituídas por várias espécies bacterianas. Para obter informações detalhadas sobre o efeito da geometria na patogenicidade, uma estratégia de impressão 3D é descrita em Connell et al. para comunidades bacterianas, nas quais populações fisicamente distintas mas quimicamente interativas de um determinado tamanho, forma e densidade podem ser organizadas essencialmente em qualquer forma (Figura 2). Usando esta abordagem, foi demonstrado que a estabilidade de uma única espécie patogénica de bactérias ao antibiótico pode aumentar a resistência da segunda espécie por causa das suas relações em 3D. Com a ajuda da técnica litográfica do laser, recipientes microscópicos de até 1 volume pl com uma espessura de parede de até 2 µm ao redor de bactérias selecionadas suspensas em gelatina foram formados por reticulação das moléculas de polipeptídeos na região focal devido à absorção não linear da radiação laser por moléculas fotossensibilizadoras. O resultado desta absorção multifotónica é a formação de oxigénio monofotónico, que estimula reacções de ligação cruzada intramolecular e intermolecular entre a BSA e a gelatina. As propriedades físicas e químicas únicas da gelatina têm motivado o interesse em seu uso para uma variedade de aplicações, incluindo armazenamento, imobilização e cultivo de bactérias em 3D. Após a remoção do reagente em excesso, as bactérias são localizadas em cavidades seladas formadas por gelatina reticulada, que é um material altamente poroso e suporta um rápido crescimento de populações de células totalmente fechadas. É facilmente permeável a polipéptidos, antibióticos e aos sinais físicos e químicos com a ajuda dos quais ocorre a interacção entre as bactérias. O isolamento das células em microcontentores proporciona oportunidades para a incorporação de diferentes tipos/densensidades de recipientes uns nos outros, assim como para mudanças dinâmicas na orientação de populações inteiras de bactérias dentro da comunidade.

Os autores demonstraram que interações espacialmente localizadas do Staphylococcus aureus Gram-positivo e da bactéria Gram-negativo P. aeruginosa (dois patógenos humanos que freqüentemente formam coinfecções persistentes dentro de feridas, cateteres e pulmão de pacientes com mucoviscidose) podem aumentar a sobrevivência do Staphylococcus no tratamento com o antibiótico β-lactam.

A impressão de células Micro-3D expande fundamentalmente as possibilidades de sondagem da resistência aos antibióticos quando um único microgrupo bacteriano pode afectar a susceptibilidade aos antibióticos das populações adjacentes circundantes ou embutidas – uma questão de particular relevância para as infecções in vivo (por exemplo, feridas, cavidade oral, e fibrose cística dos pulmões) onde os tecidos são frequentemente colonizados por várias espécies de bactérias simultaneamente. O verdadeiro poder da impressão celular 3D reside na capacidade de organizar as comunidades microbianas na gama ilimitada de geometrias. A impressão de células Micro-3D também pode ser uma ferramenta valiosa para a investigação de mecanismos e dinâmicas das respostas adaptativas às condições ambientais.