Orelhas Biônicas Impressas 3D | CDhistory

A concepção e implementação de órgãos e dispositivos biônicos que melhoram as capacidades humanas, conhecidos como cibernéticos, tem sido uma área de crescente interesse científico.1,2 Este campo tem o potencial de gerar peças de reposição personalizadas para o corpo humano, ou mesmo criar órgãos contendo capacidades além do que a biologia humana normalmente fornece. Em particular, o desenvolvimento de abordagens para a integração multidimensional direta de componentes eletrônicos funcionais com tecidos e órgãos biológicos poderia ter um tremendo impacto na medicina regenerativa, próteses e interfaces homem-máquina.3,4 Recentemente, vários relatórios descreveram o acoplamento de componentes eletrônicos e tecidos usando dispositivos e sensores planos flexíveis e/ou extensíveis que se adaptam às superfícies dos tecidos, permitindo aplicações como a detecção bioquímica e sondagem de atividades elétricas em superfícies do coração,5 pulmões,6 cérebro,7 pele8 e dentes.9 No entanto, a obtenção de componentes eletrônicos tridimensionalmente entrelaçados com tecidos e órgãos biológicos é significativamente mais desafiadora.4

A engenharia de tecidos é guiada pelo princípio de que uma variedade de tipos de células pode ser coaxada para sintetizar novos tecidos se eles forem semeados em um andaime hidrogel tridimensional apropriado dentro de um ambiente de crescimento acordado.10-15 Seguindo cultura in vivo ou in vitro, as estruturas teciduais se formam e possuem a morfologia do andaime original.16 Entretanto, um grande desafio nas abordagens tradicionais de engenharia de tecidos é a geração de implantes de sementes de células com estruturas que imitam tecido nativo, tanto em geometrias anatômicas quanto em distribuições celulares intra-tissulares.17 Técnicas como a semeadura de células em moldes não adesivos ou andaimes autodobráveis têm sido usadas para fabricar construções tridimensionais de tecido com geometrias 3D complexas.18,19 No entanto, as técnicas existentes ainda são incapazes de criar facilmente órgãos ou partes de tecidos com as necessárias heterogeneidades espaciais e geometrias anatômicas precisas para suprir a escassez de órgãos doadores para transplante.20-22 Por exemplo, a reconstrução total do ouvido externo com cartilagem autógena – com o objetivo de recriar uma orelha com aparência semelhante à aurícula contralateral – continua sendo um dos problemas mais difíceis no campo da cirurgia plástica e reconstrutiva.23

Técnicas de fabricação de aditivos como a impressão 3D oferecem uma solução potencial através da capacidade de criar rapidamente modelos de desenho assistido por computador (CAD), cortando-os em camadas e construindo as camadas para cima usando células biológicas como tintas, nas geometrias anatômicas precisas dos órgãos humanos.24-27 Variações da impressão 3D têm sido usadas como métodos de fabricação de formas livres sólidas, embora seu uso tenha sido limitado principalmente à criação de peças mecânicas passivas.24,28 A impressão 3D baseada em extrusão tem sido usada para projetar andaimes de tecido duro, como meniscos de joelho e discos intervertebrais completos com células encapsuladas.29-31 Esta técnica oferece a capacidade de criar estruturas multi-materiais espacialmente heterogêneas, utilizando ferramentas de deposição que podem extrudar uma ampla gama de materiais.32 Além disso, blocos de construção funcionais em nanoescala permitem a montagem versátil de baixo para cima de componentes macroscópicos que possuem funcionalidades sintonizáveis. Isto poderia permitir a impressão simultânea de materiais nanoeletrônicos e células biológicas para produzir tecidos e órgãos ciborgues tridimensionalmente integrados exibindo capacidades únicas.33,34

Aqui introduzimos uma abordagem conceitualmente nova que aborda os desafios acima mencionados, entrelaçando totalmente componentes eletrônicos funcionais com tecidos biológicos através da impressão 3D de materiais nanoeletrônicos e hidrogéis viáveis de sementes de células nas geometrias anatômicas precisas dos órgãos humanos. Como os circuitos eletrônicos estão no centro dos dispositivos sensoriais e de processamento de informação,35 o cultivo in vitro da arquitetura híbrida impressa permite o crescimento de “órgãos ciborgues” exibindo funcionalidades aprimoradas sobre a biologia humana. Nossa abordagem oferece a capacidade de definir e criar construções espacialmente heterogêneas através da extrusão de uma ampla gama de materiais em um processo camada por camada até que a geometria estereolitográfica final esteja completa. Este conceito de impressão 3D de células vivas em conjunto com componentes eletrônicos e o seu crescimento em órgãos funcionais representa uma nova direção na fusão da eletrônica com sistemas biológicos. De fato, tais órgãos ciborgues são distintos tanto do tecido artificial quanto da eletrônica plana/flexível e oferecem uma maneira única de alcançar uma fusão tridimensional da eletrônica com o tecido.

Como prova de conceito desta abordagem, avaliamos a capacidade da impressão 3D para criar um aurículo auditivo viável que também contenha eletrônica que permita capacidades alternativas à audição humana. Órgãos humanos constituídos predominantemente por tecido cartilaginoso, como a aurícula auditiva, representam protótipos candidatos adequados para investigar a viabilidade da nossa abordagem. Isto se deve 1) à complexidade inerente à geometria anatômica do ouvido, o que dificulta a bioengenharia através de abordagens tradicionais de engenharia de tecidos, bem como 2) à simplicidade em sua estrutura de nível de tecido cartilaginoso devido à falta de vasculatura.23,36 Além disso, a montagem bottom-up de matrizes nanoeletrônicas fornece a capacidade de gerar hierarquicamente componentes eletrônicos em escala macroscópica funcional. Especificamente, demonstramos a impressão em 3D de uma matriz de hidrogel de alginato de condrócito semeado com uma nanopartícula de prata (AgNP) infundida em bobina indutiva, conectando-se a eletrodos em forma de cóclea apoiados em silicone. Em conjunto, o resultado é a integração tridimensional de componentes eletrônicos funcionais dentro da complexa e precisa geometria anatômica de um ouvido humano (Fig. 1).

Entrelaçamento tridimensional de biologia e eletrônica via fabricação de aditivos para gerar uma orelha biônica. (A) Desenho CAD da orelha biônica. (B) (topo) Imagens ópticas dos materiais funcionais, incluindo biológicos (condrócitos), estruturais (silicone) e eletrônicos (AgNPinfused silicone) usados para formar a orelha biônica. (inferior) uma impressora 3D utilizada para o processo de impressão. (C) Ilustração da orelha biônica impressa em 3D.

Os seguintes passos estão envolvidos no processo. Primeiro, um desenho CAD do ouvido biônico (Fig. 1A) é usado para prescrever a geometria anatômica e a heterogeneidade espacial dos vários materiais funcionais. Como descrito acima, três materiais compreendem os três constituintes funcionais (estrutural, biológico e eletrônico) da orelha biônica. Estes materiais são alimentados em uma impressora Fab@Home 3D baseada na extrusão de seringas (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Fig. 1B). A construção do ouvido híbrido bioeletrônico impresso é então cultivada in vitro para permitir o crescimento de tecido cartilagíneo para formar um ouvido ciborgue com a capacidade de detectar sinais eletromagnéticos na faixa de radiofreqüência (RF) por meio de uma bobina indutiva atuando como antena receptora (Figura 1C).

Para demonstrar nossa abordagem, nós imprimimos a construção do ouvido biônico da seguinte forma. Para o andaime, nós pré-sedamos uma matriz de hidrogel de alginato com condrócitos viáveis a uma densidade de ~60 milhões de células/mL (Veja Informações de Suporte). A matriz de alginato é tridimensionalmente estável em cultura, não tóxica, compatível com pré-semeadura e extrusão, e um veículo de entrega celular adequado, pois a ligação cruzada pode ser iniciada antes da deposição.37 Os condrócitos usados para a impressão foram isolados da cartilagem articular de bezerros de um mês de idade (Astarte Biologics, Redmond, WA). Um desenho CAD de uma aurícula auricular humana em formato estereolitográfico (STL) com uma antena circular integrada conectada a eletrodos em forma de cóclea foi utilizado para definir os caminhos de impressão através do corte do modelo em camadas de contorno e caminhos de preenchimento raster. O crosslinking foi iniciado na matriz de alginato hidrogel pré-semeado com condrócitos viáveis, que foi então impresso em 3D juntamente com soluções de silicone condutor (AgNP-infused) e não condutor (Movie 1). Juntos, este método produziu os componentes biológicos, eletrônicos e estruturais do órgão biônico em um único processo.

Figure 2A mostra a orelha biônica impressa em 3D imediatamente após a impressão. Notavelmente, é encontrado para reproduzir fielmente o desenho CAD, na espacialidade precisa para cada material, conforme ditado pelo desenho. A orelha impressa foi imersa em meio de cultura de condrócitos contendo 10% ou 20% de soro fetal bovino (FBS), que foi refrescado a cada 1-2 dias (Ver Informações de Suporte). A orelha híbrida mostrou boa integridade estrutural e retenção da forma em cultura (Fig. 2B). Com o tempo, a construção tornou-se gradualmente mais opaca; isto foi mais aparente após quatro semanas de cultura, e é grosseiramente consistente com o desenvolvimento de uma matriz extracelular (ECM). A morfologia bruta do ouvido biônico após 10 semanas de cultura in vitro é mostrada nas Informações de Suporte.

Crescimento e viabilidade da orelha biónica. (A) Imagem da orelha biônica impressa em 3D imediatamente após a impressão. (B) Imagem da orelha biônica impressa em 3D durante a cultura in vitro. As barras de escala em (A) e (B) são de 1 cm. (C) Viabilidade do condrócito em várias fases do processo de impressão. As barras de erro mostram o desvio padrão com N=3. (D) Variação do peso da orelha impressa ao longo do tempo em cultura, onde a orelha consiste em alginato condrócito (vermelho) ou apenas alginato (azul). As barras de erro mostram o desvio padrão com N=3. (E) Avaliação histológica da morfologia dos condrócitos usando a coloração H&E. (F) Coloração de Safranina O do tecido neocartilaginoso após 10 semanas de cultura. (G) Fotografia (topo) e imagens fluorescentes (fundo) mostrando viabilidade do tecido neocartilaginoso em contato com a antena helicoidal. (H) Fotografia (superior) e imagens fluorescentes (inferior) de uma seção transversal da orelha biônica mostrando viabilidade do tecido cartilaginoso interno em contato com o eletrodo. As barras da escala superior são de 5 mm; inferior são 50 μm.

Viabilidade foi testada imediatamente antes e durante as várias etapas do processo de impressão. A viabilidade inicial das células foi determinada após a cultura usando um ensaio de exclusão de células azuis Trypan (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) e foi encontrada a 96,4 ± 1,7% (Fig. 2C) (Ver Informações de Suporte). A orelha de alginato de semente de célula impressa também foi testada com um ensaio de viabilidade LIVE/DEAD® (Sondas Moleculares, Eugene, OR) e exibiu uma viabilidade celular de 91,3 ± 3,9% com distribuição homogênea de condrócitos. Este resultado sugere que o processo de impressão, incluindo o encapsulamento e deposição das células, não tem um impacto considerável na viabilidade dos condrócitos.

Notavelmente, esta abordagem de imprimir uma matriz de hidrogel pré-sementeira elimina os maiores problemas associados com as limitações de profundidade de semeadura e semeadura não-uniforme nos métodos tradicionais de semeadura de andaimes 3D pré-moldados. Semeando condrócitos em uma matriz de alginato bioabsorvível e moldando-a via impressão 3D, as células localizam-se em uma geometria desejada, permitindo a produção de novos ECM em locais definidos quando cultivados em meios nutritivos. À medida que o tecido se desenvolve, o andaime polímero é reabsorvido (Fig. 2D), para que o novo tecido mantenha a forma do polímero em que as células foram semeadas. O andaime biodegradável proporciona a cada célula um melhor acesso aos nutrientes e uma remoção mais eficiente dos resíduos.

Próximo, foi utilizada avaliação histológica para comparar a morfologia dos condrócitos na neocartilagem do ouvido biônico com a do tecido cartilaginoso nativo. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) revelou distribuição uniforme dos condrócitos nas construções (Fig. 2E) (Ver Informações de Suporte). A histologia do tecido auditivo com coloração Safranin O indicou um acúmulo relativamente uniforme de proteoglicanos no tecido auditivo cultivado (Fig. 2F). Estes dados bioquímicos são consistentes com o desenvolvimento de novas cartilagens.38 Finalmente, medidas fluorescentes foram usadas para verificar a viabilidade do tecido auditivo biônico impresso em 3D após 10 semanas de cultura de crescimento in vitro usando corantes de diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propidium (PI). As figuras 2G e 2H mostram o tecido que cobre a antena da bobina e o tecido interno que está em contato com o eletrodo que passa perpendicularmente através do tecido, respectivamente. Em ambos os casos, a cartilagem cultivada apresentou excelente morfologia e viabilidade ao nível do tecido. Notavelmente, esta abordagem de cultivar tecido na presença de materiais eletrônicos abióticos poderia minimizar a resposta imunológica do tecido cultivado.

Disfuncionamos então as propriedades mecânicas da cartilagem em vários estágios de crescimento, já que o desenvolvimento de ECM correlaciona-se fortemente com as propriedades mecânicas do tecido em desenvolvimento.39 Primeiro, foram realizadas caracterizações bioquímicas e histológicas extensivas. Foram retiradas amostras de culturas contendo 10% e 20% de FBS a 2, 4, 6, 8 e 10 semanas e congeladas para medir o conteúdo de DNA da neocartilagem e para avaliação bioquímica do ECM (Ver Informações de Suporte). O acúmulo de ECM nas construções foi avaliado quantificando a quantidade de dois componentes importantes do ECM: 1) hidroxiprolina (HYP) como marcador do conteúdo de colágeno, e 2) glicosaminoglicano sulfatado (GAG) como marcador de proteoglicanos. Na semana 10, o conteúdo de HYP aumentou para 1,2 ± 0,1 μg/mg e 1,4 ± 0,2 μg/mg para culturas contendo 10% e 20% de FBS, respectivamente (Fig. 3A). Os valores correspondentes do conteúdo de GAG para a semana 10 foram 10,6 ± 0,6 μg/mg e 12,2 ± 1,0 μg/mg (Fig. 3B). Este aumento no conteúdo de GAG e HYP indica que os condrócitos estão vivos e metabolicamente ativos em cultura.

Próximo, propriedades de tração foram analisadas testando amostras de condrócitos-condrócitos-alginato impressos em 3D em vários pontos de cultura, nos quais os ossos do cão continham as mesmas densidades de células e condições de cultivo idênticas à orelha (Veja Informações de Suporte). A avaliação das propriedades mecânicas indicou que o módulo de Young dos ossos do cão aumentou com o tempo de 14,16 kPa para 111,46 kPa na semana 10 (Fig. 3C). Os ossos de cachorro de menor densidade de condrócitos de 20 milhões de células/mL também foram testados sob condições similares para entender o efeito da densidade inicial de condrócitos nas propriedades mecânicas do tecido cultivado. Verificou-se que estes possuem um módulo Young inferior de 73,26 kPa na semana 10. Em seguida, a dureza do tecido cartilaginoso cultivado da aurícula impressa em 3D foi caracterizada por medidas de nanoindentação. As indentações foram realizadas nos vários locais anatômicos da aurícula (Fig. 3D). Como mostrado na Tabela 1, esses valores de dureza foram encontrados relativamente uniformes, variando de 38,50 kPa a 46,80 kPa, confirmando a integridade estrutural da orelha impressa.40

Para demonstrar as funcionalidades melhoradas do ouvido biônico impresso em 3D, realizamos uma série de caracterizações elétricas. Primeiro, a resistividade da antena da bobina foi medida utilizando quatro pontos de medição da sonda e se constatou ser dependente da vazão volumétrica utilizada para a impressão do silicone condutor de AgNP-infusão (Ver Informações de Suporte). Na vazão ótima, a resistividade da bobina impressa foi encontrada em 1,31 × 10-6 Ω-m, que é apenas duas ordens de magnitude maior que a prata pura (1,59 × 10-8 Ω-m). A seguir, realizamos experimentos de recepção de radiofreqüência sem fio. Para demonstrar a capacidade do ouvido biônico de receber sinais além das freqüências normais de sinais audíveis (em humanos, 20 Hz a 20 kHz), formamos conexões externas para os eletrodos em forma de cóclea provenientes da bobina indutiva do ouvido biônico (Figura 4A). A orelha foi então exposta a ondas senoidais de freqüências que variavam de 1 MHz a 5 GHz. O parâmetro S21 (coeficiente de transmissão para frente) da antena da bobina foi analisado utilizando um analisador de rede e foi encontrado para transmitir sinais através deste espectro de freqüências estendido (Fig. 4B).

Mais importante, como exemplo demonstrativo da versatilidade na modificação do órgão final através da modificação do desenho CAD, imprimimos um ouvido complementar esquerdo simplesmente reflectindo o modelo original (ver Informação de suporte). Os canais esquerdo e direito do áudio estereofônico foram expostos ao ouvido biônico esquerdo e direito através da transmissão de antenas de loop magnético com núcleos de ferrite (Fig. 4C). Os sinais recebidos pelos ouvidos biônicos foram coletados da saída do sinal dos eletrodos em forma de cóclea dupla e alimentados em um osciloscópio digital e reproduzidos por um alto-falante para monitoração auditiva e visual. Excertos dos sinais transmitidos e recebidos com duração de 1 ms, tanto para os ouvidos biónicos direito como esquerdo, são mostrados na Figura 4D e apresentam uma excelente reprodução do sinal de áudio. Significativamente, a música reproduzida (a “Für Elise” de Beethoven) do sinal recebido pelos ouvidos biônicos possuía boa qualidade sonora (Filme 2).

Em resumo, os “ouvidos ciborgues” de Beethoven foram fabricados que são capazes de receber sinais eletromagnéticos em uma faixa de freqüência expansiva de Hz a GHz. Nossa estratégia representa uma prova de princípio de entrelaçar a versatilidade das técnicas de fabricação de aditivos com os conceitos de montagem de nanopartículas e engenharia de tecidos. O resultado é a geração de órgãos biônicos de boa fé, tanto na forma como na função, conforme validado por benchmarks de engenharia de tecidos e medições elétricas. Tais híbridos são distintos dos tecidos artificiais ou da eletrônica planar/flexível e oferecem uma forma única de obter uma integração perfeita da eletrônica com os tecidos para gerar órgãos ciborgues “fora da prateleira”. Finalmente, o uso da impressão 3D com outras classes de blocos funcionais de construção em nanoescala, incluindo nanopartículas semicondutoras, magnéticas, plasmônicas e ferroelétricas, poderia expandir as oportunidades de engenharia de tecidos e órgãos biônicos.