A Resposta Ocular a uma Injeção Intracameral
Foi sugerido que as células monocitárias F4/80+ centrais à indução do ACAID eram íris residente e células do corpo ciliar que emigravam da íris através do Canal de Schlemm1,6,10 para a circulação. Como o antígeno está presente no olho por pelo menos 24 horas, o antígeno pode ter um efeito de “depósito”, embora algum antígeno esteja na circulação rapidamente após a injeção intra-cameral do antígeno.8 Como a injeção intra-cameral de antígeno induz o aparecimento de PBMC indutor de ACAID, é provável que essas células monocitárias, ao invés de apenas o antígeno circulante induza ACAID.
Uma injeção intravitreal de antígeno induz uma infiltração de células monocitárias na retina como um estágio inicial da uveíte.11,12 Além disso, a infecção ocular induz um forte infiltrado inflamatório na câmara posterior ou anterior.12-14 Consistente com tal inflamação, há um aumento de citocinas inflamatórias nos fluidos oculares, como o humor aquoso. Assim, uma injeção intracameral de antígeno particulado induz um aumento do mRNA para TNF-α sugerindo uma resposta inflamatória precoce na câmara anterior.14,15 Além disso, a supressão sistêmica da hipersensibilidade retardada do tipo não é induzida em camundongos que recebem uma injeção intracameral de anticorpos para TNF-α juntamente com antígeno sugerindo que TNF-α é necessária durante a indução do ACAID. Além disso, a indução do ACAID nestas investigações dependeu do calibre da agulha utilizada para a injeção intra-cameral de proteínas solúveis e se o antígeno estava na forma de partículas ou solúvel.15 Estes autores sugeriram que a injeção intra-cameral de antígenos de partículas e/ou o tamanho da agulha utilizada para injeções intra-camerais induz um trauma necessário para induzir o ACAID. Macrófagos e células dendríticas que expressam o marcador celular dendrítico CD11c são residentes na íris, corpo ciliar e coróide no segmento anterior.8,10,16,17 O antígeno injetado na câmara anterior é rapidamente absorvido por essas células. Além disso, macrófagos e células dendríticas são encontrados perto do Canal de Schlemm17,18, que se acredita ser o local de saída de células F4/80+ da câmara anterior para a circulação.1 Entretanto, a saída de células residentes do íris que engolfam antígeno para a circulação tem sido questionada.16 O antígeno solúvel sai rapidamente da câmara anterior através da circulação e distribui de forma semelhante ao antígeno intravenoso.8 Alguns dos antígenos que saem do olho podem estar em forma tolerogênica.19 No entanto, é provável que o antígeno intracâmara seja apresentado no timo e no baço através do chamado “antígeno tolerogênico apresentando células” que saíram do olho com antígeno. Além disso, TGF-β em humor aquoso ou produzido por células F4/80+ da íris induz um fenótipo supressivo em células F4/80+ periféricas10,20,21 sugerindo que a indução de um fenótipo supressivo em células F4/80+ ocorre em câmara anterior.
Similiar ao tratamento de células F4/80+ periféricas com humor aquoso e antígeno, a incubação de células F4/80+ peritoneais com antígeno e TGF-β in vitro impõe um fenótipo supressivo às células. Quando estas células são injetadas iv em ratos ingênuos induzem células T reguladoras esplênicas específicas para antígenos semelhantes às obtidas pela injeção intracâmara de antígeno.21 O ACAID é induzido por muito poucas células F4/80+ tratadas desta forma1 sugerindo que células (indetectáveis) emigradas da íris e do corpo ciliar podem induzir o ACAID. Além disso, células F4/80+ da íris recuperadas de camundongos que receberam uma injeção intracameral de antígeno induzem a indução de ACAID ou conferem ao F4/80+ PBMC um fenótipo supressor semelhante ao das células circulantes recuperadas de camundongos que receberam uma injeção intracameral de antígeno.9,21 É provável que o antígeno absorvido e processado pelas células que apresentam antígenos da íris possa ser transferido para o PBMC que se infiltrou na câmara anterior da mesma forma que o antígeno é transferido para células B indutoras de ACAID no baço através de células de exsudado peritoneal tratadas com TGF-β.22 Em conjunto, estas observações sugerem que eventos que ocorrem dentro da câmara anterior poderiam induzir um fenótipo supressor nas células inflamatórias não residentes que se infiltraram na câmara anterior.
Baseado nas considerações acima, investigamos a possibilidade de que a injeção intracâmara de antígeno induza um influxo de PBMC circulante para a câmara anterior devido ao trauma da injeção. Estas células infiltradas seriam expostas ao imunossupressor TGF-β em humor aquoso e células dendriformes residentes da íris/corpo arterial que poderiam apresentar o antígeno injetado na PBMC infiltrada. Contingente a esta hipótese, as células que foram recrutadas para a câmara anterior devido à lesão causada pela injeção, em seguida, recirculam e voltam para o timo e baço onde induzem células T reguladoras.
Em 3 horas após a injeção intra-cameral de ovalbumina (OVA) também encontramos um aumento de TNF-α no humor aquoso, como descrito por Ferguson et al.15 Além disso, observamos um aumento da quimiocina MCP-1 em humor aquoso seis horas após a injeção intra-cameral (Fig. 1). Uma agulha sem injeção de PBS induziu o aparecimento de TNF-α no humor aquoso e a injeção de PBS só aumentou a quantidade de TNF-α cinco vezes mais do que a obtida por uma agulha em bastão. A TNF-α no humor aquoso diminui rapidamente e não é detectada 12 horas após a injeção intra-cameral de ovalbumina (OVA) (dados não mostrados). A MCP-1 é mantida em humor aquoso por um período mais longo. No entanto, ao contrário da TNF-α, os níveis máximos de MCP-1 são atingidos em humor aquoso por 12 horas e permanecem até 16 horas após a injeção intra-cameral de OVA (dados não mostrados). Este aumento nos níveis de TNF-α e MCP-1 no humor aquoso após a injeção intra-cameral de antígeno sugere o início de uma resposta inflamatória na câmara anterior. Além disso, o TNF-α não é aumentado no humor aquoso nem é induzido ACAID se a agulha utilizada para a injeção intra-cameral for muito pequena e/ou o antígeno não for inflamatório.15
A injeção intra-cameral de antígeno eleva o TNF-a e o MCP-1 no humor aquoso. Três a seis horas após 6-8 semanas de vida, os ratos BALB/c fêmeas naïve receberam iv 5 × 106 – 1 × 107 CFSE, os ratos foram anestesiados com uma injecção ip de cetamina/xilazina7 e receberam uma injecção intra-cameral de PBS, PBS + 50 μg OVA ou uma agulha em bastão apenas com uma agulha de 24 g. Seis horas após os ratos ingénuos terem recebido uma injecção intra-cameral, o humor aquoso foi recuperado dos ratos eutanizados e 10 μl testados por ELISA para TNF-α e MCP-1. Os dados representam a média +/- S.E.M. pg detectada de 4-6 réplicas/grupo em 2-3 experimentos.
Para determinar se há um influxo concomitante de células inflamatórias na câmara anterior após a injeção intracameral de antígeno, os camundongos injetados iv com PBMC rotulado com o corante fluorescente CFSE também receberam uma injeção intracameral. Usando esta abordagem, observamos um influxo significativo de células monocitárias F4/80+, marcadas e não marcadas com CFSE (hospedeiro), que expressam os receptores quimiocinéticos CCR2 e CCR5, como mostrado por uma recuperação destas células dos irides dos ratos 24 horas após os ratos terem recebido uma injeção intra-cameral de antígeno. Não houve aumento destas células nos controles que receberam PBMC marcados com iv CFSE mas não receberam injeção intra-cameral de antígeno.23 Aproximadamente 48 horas após a injeção intra-cameral de antígeno, o número de células infiltradas na íris diminui e aumenta no timo e no baço (Fig. 2). Este aumento de células monocitárias circulantes na íris é provável devido a uma infiltração de monócitos circulantes em resposta ao trauma da injeção intra-cameral +/- o irritante da PBS e/ou antígeno/PBS porque o número de células monocitárias infiltradas aumentou quando os ratos receberam antígeno intra-cameral: a infiltração de PBMC marcada com CFSE induzida apenas por injeção foi <injeção de PBS <injeção de TNP-BSA/PBS. As células monocitárias recrutadas para a íris após a injeção intra-cameral de antígeno expressam tanto CCR2 quanto CCR5.23 A migração das células para a íris requer a expressão de CCR2 mas não de CCR5 porque CCR2 -/- PBMC não abriga a íris mas CCR5 -/- PBMC abriga a íris após a injeção intra-cameral de antígeno. Além disso, a injeção intra-cameral de OVA em camundongos CCR2 -/- não induz a circulação de células monocitárias que transferem a supressão da hipersensibilidade retardada (DTH) para OVA quando injetada iv em receptores do tipo selvagem.23
Migração de PBMC após a injeção intra-cameral. Ratos BALB/c anestesiados7 receberam uma injeção intra-cameral de albumina bovina trinitrofenilada seis horas após os ratos terem recebido iv 5 × 106 -1 × 107 PBMC marcados com CFSE. Vinte e quatro horas após a injeção intra-cameral os ratos foram eutanizados por inalação de CO2 e os irides, baços e timos foram removidos, agrupados e preparados com suspensões de células únicas. As células foram então rotuladas com ficocianina-anti-F4/80 e analisadas por citometria de fluxo. O aumento percentual de células CFSE, F480+ foi calculado por: