Uma importante modificação pós-tradução das histonas é a acetilação de ɛ- grupos de aminoácidos em resíduos conservados de lisina presentes nas caudas amino-terminais destas proteínas. A acetilação neutraliza as lisinas carregadas positivamente e, portanto, afeta as interações das histonas com outras proteínas e/ou com o DNA. A acetilação do histone está há muito associada à cromatina transcritivamente ativa e também implicada na deposição do histone durante a replicação do DNA (1, 2). A primeira clonagem de um gene da histona acetiltransferase (HAT), o gene da levedura HAT1, foi relatada em 1995 (3). Posteriormente, foi sugerido que a proteína HAT1 é citoplasmática e envolvida na deposição de histona (4), apesar da falta de fenótipos de mutantes da levedura Hat1, bem como evidências recentes de que tanto as enzimas humanas como as enzimas da levedura são nucleares (ref. 5; S. Tafrov e R.S., trabalho inédito), torna a função in vivo do HAT1 pouco clara.
Um grande avanço neste campo foi a purificação e clonagem do HAT A, um HAT do macronúcleo do ciliado Tetrahymena (6). A sequência de HAT A mostrou que era semelhante a um conhecido coactivador transcripcional de levedura, o GCN5. Desde então, numerosos estudos demonstraram que o GCN5 (e o P/CAF relacionado) são CHAT conservados cuja actividade nos nucleossomas facilita o início da transcrição (revisto na ref. 7). Curiosamente, o GCN5 por si só pode acetilar histórias livres (particularmente Lis-14 de H3), mas não os nucleossomas. A acetilação dos nucleossomas pelo GCN5 requer que este esteja num de dois grandes complexos proteicos chamados Ada e SAGA em leveduras (8). Nos últimos anos várias proteínas de mamíferos, não relacionadas com o GCN5 mas também implicadas na activação transcripcional, têm demonstrado ter actividade HAT. Estas incluem CBP/p300, TAF250, ACTR, e SRC-1 (9-12). Assim, está ficando claro que a acetilação histórica dos nucleossomos é um componente significativo do processo de ativação do gene em múltiplas etapas.
Neste número do Proceedings, Trievel et al. (13) relatam a estrutura cristalina do domínio catalítico HAT do GCN5 da levedura. Este domínio abrange os resíduos 99-262 da proteína 439-aa. Uma porção da sua estrutura, composta por quatro antiparalelas β (β1-4), seguida por uma hélice α (α3) e outra β (β5), é mostrada na Fig.1.1. Esta parte do GCN5 é muito semelhante em estrutura à da levedura HAT1 (14), bem como a duas outras N-acetiltransferases cujos substratos não são históricos, nomeadamente a aminoglicosídeo 3-N-acetiltransferase (AAT; ref. 15) e a serotonina N-acetiltransferase (16). Todas estas enzimas são membros de uma família de proteínas identificadas pela análise sequencial como sendo semelhantes às N-acetiltransferases conhecidas como GCN5, e portanto chamadas de superfamília GNAT (17). Os membros desta superfamília têm a característica comum de transferir um grupo acetil CoA de acetil CoA para um grupo amino primário, embora muito diferentes grupos amino para as diferentes enzimas; ou seja, em ɛ- grupos de aminoácidos em lisinas no caso da HAT, em α- grupos de aminoácidos no terminal N de proteínas no caso de enzimas como ARD1 ou MAK3, em açúcares no caso da AAT (15) e GNA1 (18, 19), ou em serotonina para a serotonina N- acetiltransferase (16). Todos os membros da superfamília GNAT têm um motivo conservado chamado motivo A (mostrado em vermelho na Fig. 1),1), e a maioria deles tem dois outros motivos conservados chamados B e D.
Diagrama de Ribbono do GCN5 mostrando o núcleo conservado encontrado em quatro N-acetiltransferases e em uma N-miristoiltransferase. O motivo A da superfamília GNAT é mostrado em vermelho. Acetil CoA como presente no HAT1 é modelado na estrutura do GCN5. O enxofre em acetil CoA é mostrado em amarelo.
Foi previsto que os motivos conservados na superfamília GNAT estariam envolvidos na ligação de acetil CoA porque é o único substrato que estas diversas N-acetiltransferases têm em comum (17). De fato, a estrutura do HAT1 com acetil CoA ligado confirmou que o motivo A está envolvido na ligação de CoA (14), assim como o trabalho estrutural com aminoglicosídeo 3-N-acetiltransferase (15) e serotonina N-acetiltransferase (20). Na Fig. 11 a acetil CoA foi modelada na estrutura GCN5, com base na sua posição no HAT1 (13, 14). A acetil CoA é ligada em uma fenda em forma de V, formada entre as cordas 4 e 5 do β. O motivo A altamente conservado da família GNAT liga-se à fracção de pirofosfato de acetil CoA. As unidades de pantotenato e β-mercaptoetanolamina de CoA são orientadas ao longo de β4 e ligadas a ele por hidrogênio, imitando assim uma corda β.
Trievel et al. (13) propõem um mecanismo de catálise por GCN5. Eles sugerem que um resíduo de glutamato (Glu-173) é posicionado para abstrair um próton de um grupo NH3+ sobre a lisina a ser acetilada, de modo que o grupo amino não carregado possa então realizar um ataque nucleofílico sobre o carbono carbonilo do grupo tioéster reativo da acetil CoA. Fig. 22 mostra uma sobreposição das supostas regiões ativas do GCN5 (em amarelo) e HAT1 (em vermelho) com acetil CoA ligado. Novamente, observe como as duas proteínas são estruturalmente semelhantes nesta região. De acordo com a proposta de Trievel et al., o Glu-173 do GCN5, especialmente após a reorientação de sua cadeia lateral, estaria suficientemente próximo da lisina de entrada para realizar a catálise de base. De fato, a mutação de Glu-173 para Gln suprime a atividade in vivo e in vitro (13). Não há resíduos de Glu ou Asp na posição correspondente no HAT1. Observamos, entretanto, que o Glu-255 ou Asp-256 do HAT1 na coluna adjacente β da fenda estão posicionados de forma que possam desempenhar a mesma função catalítica (Fig. (Fig.2).2). Esses resíduos ainda não foram mutados.
Superposição de β4-α3-β5 do GCN5 (amarelo) e a região correspondente do HAT1 (vermelho). As proteínas são representadas como vestígios de Cα com acetil CoA ligado. Glu-173 do GCN5, acredita-se estar envolvido na catálise, é mostrado na representação em bola e bastão, assim como os resíduos Glu-255 e Asp-256 de HAT1.
Está claro a partir das estruturas do GCN5, HAT1, e dois outros membros da superfamília GNAT que eles compartilham um núcleo conservado, incluindo o local de ligação para acetil CoA (Fig. (Fig.1).1). Curiosamente, a N-myristoyl transferase tem uma estrutura similar às N-acetiltransferases discutidas acima (21, 22), embora essa enzima transfira um grupo acilo muito maior de miristoyl CoA para α-amino grupos de glicinas no terminal N das proteínas do substrato. Por outro lado, a acetiltransferase de cloranfenicol, que acetila um grupo hidroxila, não tem uma estrutura semelhante. Parece que as enzimas GNAT que acetilam amino grupos em um conjunto diversificado de substratos ligam a acetil CoA de forma muito semelhante, e talvez compartilhem um mecanismo catalítico semelhante. É claro que estas enzimas irão diferir nas regiões que ligam o substrato a ser acetilado. Quanto aos HATs, o próximo objectivo será determinar uma estrutura com um histone ou substrato peptídeo ligado à enzima.