Implicações Estruturais
O resultado da modificação da proteína mutante contendo cisteína (K41C) com bromoethylamine é uma enzima bastante relacionada com a RNase A do tipo selvagem. A diferença entre as duas proteínas deve estar nas diferenças entre um grupo de tioeter e um grupo de metileno. Embora os ângulos das ligações C-S-C tendam a ser mais agudos que os das ligações C-CH2-C, essa diferença é compensada pelo maior comprimento das ligações C-S.3g,14 A modelagem molecular indica que os grupos de aminas primárias em S-etilaminocisteína e lisina podem ser sobrepostos a 0,1 Å. Uma diferença mais significativa entre S-etilaminocisteína e lisina é sua relativa preferência por ângulos gaúchos ao invés de ângulos antitorção.15 A antiformação das ligações CC-CC é favorecida por aproximadamente 0,8 kcal/mol nos compostos do modelo.16 De fato, o ângulo de torção médio de K41 é (175 ± 3)° no complexo do RNase A com cíclico 2′,3′-uridina vanadate (U>v), um suposto estado de transição análogo (Figura 2). Em contraste com as ligações CC-CC, a conformação gaúcha das ligações CS-CC é favorecida por 0,05-0,20 kcal/mol.17 A modelagem molecular indica que a ligação CS-CC de um resíduo de S-ethylaminocysteine na posição 41 pode estar na conformação gaúcha sem perturbar a estrutura da proteína nativa. Assim, as cadeias laterais do tioéter na posição 41 são provavelmente menos rígidas e estendidas do que as cadeias laterais alquílicas. Portanto, supomos que a catálise pela enzima S-ethylaminocysteine não é tão eficiente quanto a da RNase A do tipo selvagem, devido ao custo entropico de fixar um tioéter em toda a anti-conformação.
Estrutura do site ativo da RNase A ligado à uridina 2′,3′-cyclic vanadate. A estrutura foi refinada a 2,0 Å a partir de dados de raios X e difração de nêutrons coletados de cristais cultivados a pH 5,3. A cadeia lateral da fenilalanina 120 e a base do uracil não são mostradas.
Eficiência catalítica depende do comprimento da cadeia lateral do resíduo 41. As variantes do RNase A que apresentam um grupo amino no final de uma cadeia lateral mais longa do que a da lisina são catalisadores mais ativos do que o não modificado K41C RNase A. Assim, o comprimento adicional é tolerado no local ativo. Ainda assim, as enzimas em que um grupo amino na posição 41 está separado da cadeia principal por 4 átomos são mais ativas do que aquelas separadas por 5 átomos. Este resultado pode surgir da entropia conformacional adicional ou ângulos de torção desfavoráveis de cadeias laterais mais longas.
Nenhuma vantagem significativa é obtida se o resíduo 41 pode doar uma segunda ligação de hidrogênio. Os grupos Guanidino e acetamidino têm o potencial de interagir simultaneamente com mais de um oxigênio de um grupo fosforilo. Por exemplo, um grupo guanidino é usado para ligar grupos fosforilo pela proteína HIV-1 Tat18 e por receptores artificiais.19 Além disso, em nuclease estafilocócica e ribonucleases da família T1, uma arginina parece desempenhar o papel do K41 na RNase A.20 Substituímos o K41 por um resíduo de arginina e um resíduo de S-acetamidino, que é um pequeno análogo de arginina. Os valores de ΔΔG‡ para estas enzimas são menores que os das enzimas análogas com apenas um grupo amino primário na cadeia lateral da posição 41. Assim, uma ligação de hidrogênio parece ser suficiente para efetuar uma catálise eficiente. Este resultado é consistente com o complexo cristalino da RNase A com U>v (Figura 2). O grupo vanadil em U>v é uma bipirâmide trigonal aproximada com dois oxiógenos equatoriais não ponteados, O1V e O3V. O oxigênio O1V aceita uma ligação de hidrogênio da cadeia lateral da glutamina 11 enquanto o O3V aceita uma ligação de hidrogênio da cadeia principal da fenilalanina 120. Apenas O1V aceita uma ligação de hidrogênio de K41.
Mechanistic Implications. O papel catalítico mais comumente atribuído ao K41 é estabilizar o excesso de carga negativa acumulada sobre os oxigenados fosforilo não-pensáveis durante a clivagem do RNA (Figura 2). A acumulação de carga pode ocorrer em um estado de transição pentacoordenada (ou intermediário de fosforano) quando o grupo 2′ hydroxyl ataca o fósforo, no caminho para o deslocamento do nucleósido 5′. Tem sido assumido que esta estabilização ocorre por interações Coulombic.12c,21 Mas, também tem sido proposto recentemente que a estabilização ocorre por meio de uma ligação de hidrogênio curta e forte envolvendo a transferência parcial de um próton de K41,22
As características salientes de um resíduo de lisina são sua carga positiva e sua capacidade de doar ligações de hidrogênio. Três das 5 enzimas semi-sintéticas, assim como K41R, partilham estas características. Não é uma questão simples diferenciar entre uma interacção baseada apenas em forças Coulombic e uma baseada em ligações de hidrogénio entre duas espécies carregadas. O que se segue é a explicação mais simples que é consistente com os dados da Tabela 1.
A distinção entre ligações de hidrogênio e forças Coulombic é mais evidente em nenhum lugar do que em uma comparação da enzima S-ethyltrimethylaminocysteine, que possui uma carga positiva terminal mas sem capacidade de doar uma ligação de hidrogênio, e a enzima S-acetamidocysteine, que possui uma amida N-H para potencial doação de ligações de hidrogênio mas sem uma carga positiva. A baixa atividade catalítica da enzima S-ethyltrimethylaminocysteine argumenta fortemente contra a eficácia das forças coulombic na estabilização do estado de transição. Sendo tudo mais igual, a energia de uma interação carga-carga diminui apenas como o inverso da distância. Uma maior distância entre a carga positiva na cadeia lateral e os oxigenados fosforilo, em relação à da enzima S-ethylaminocysteine, é imposta pelos grupos metilo. Ainda assim, é improvável que essa distância seja suficientemente grande para causar a redução observada >103 vezes em kcat/Km, especialmente porque os três grupos metilo poderiam ser facilmente acomodados nas proximidades dos oxiógenos fosforílicos (Figura 2).
A força de uma ligação de hidrogênio deve se correlacionar inversamente com a pKa do próton a ser doado, na medida em que a ligação de hidrogênio envolve alguma extensão de transferência de prótons.23 Como mostrado na Tabela 1, aumentos na pKa correspondem de fato a diminuições em ΔΔG‡ para enzimas semissintéticas com cadeias laterais de comprimento comparável. Para aquelas enzimas semi-sintéticas em que os comprimentos das cadeias laterais são comparáveis à lisina, a correlação é, no entanto, não linear. Esta falta de linearidade pode surgir porque a pKa de cada cadeia lateral depende do seu ambiente particular na proteína nativa. De fato, a pKa de Lys41 foi determinada como sendo 9,0,24 ao invés de 10,6 como está listada para o íon butilamônio na Tabela 1. Diferentes cadeias laterais podem ser afetadas em diferentes extensões. Outra fonte, talvez mais significativa, de não linearidade é que as espécies carregadas tendem a participar de ligações de hidrogênio mais fortes do que as espécies não carregadas. Este fenômeno tem sido observado para proteínas25 assim como para moléculas pequenas, incluindo aminas.26 A comparação de enzimas semi-sintéticas com cadeias laterais que são isostéricas mas diferem em carga formal deve revelar qualquer tendência desse tipo. Por exemplo, nas enzimas S-acetamidinocisteína e S-acetamidocisteína, as cadeias laterais na posição 41 são idênticas, exceto por um dos dois heteroátomos ligados ao carbono terminal. No entanto, a diferença na capacidade dessas duas cadeias laterais isólogas de se ligarem ao estado de transição é maior do que a esperada apenas de suas acidezes. Aqui, a ligação de hidrogênio doada de uma acetamidina carregada é 4 kcal/mol mais forte do que a de uma amida não carregada. Este valor é consistente com outros dados sobre as forças relativas das ligações de hidrogênio carregadas e não carregadas nas interações proteína-ligante.21 Finalmente, é notável que embora a cadeia lateral S-acetamido não tenha uma carga formal e tenha uma pKa relativamente alta, ela ainda contribui (embora modestamente) para a catálise. Este resultado fornece mais evidências da importância para a catálise de uma ligação de hidrogênio doada pelo resíduo 41,