Poder diagnóstico de testes laboratoriais para esferocitose hereditária: um estudo comparativo em 150 pacientes agrupados de acordo com as características moleculares e clínicas

Abstract

Background O diagnóstico laboratorial da esferocitose hereditária geralmente se baseia em testes de fragilidade osmótica baseados em NaCl ou glicerol; mais recentemente, foi proposto um ensaio diretamente direcionado ao defeito molecular da esferocitose hereditária (eosin-5′-maleimide-binding test). Nenhum dos testes disponíveis identifica todos os casos de esferocitose hereditária.Desenho e Métodos Comparamos o desempenho do teste de ligação eosina-5′-maleimida, estudos de fragilidade NaCl-osmotic no sangue fresco e incubado, o teste de lise de glicerol, o teste de lise de glicerol acidificado e o teste Pink em uma série de 150 pacientes com esferocitose hereditária agrupados de acordo com o fenótipo clínico e a proteína defeituosa, com o objetivo final de encontrar a combinação de testes associados com o maior poder diagnóstico, mesmo nos casos mais leves de esferocitose hereditária.Resultados O teste de ligação eosina-5′-maleimida teve uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 98% para a detecção da esferocitose hereditária: a sensibilidade foi independente do tipo e quantidade de defeito molecular e do fenótipo clínico. O teste de lise com glicerol acidificado e o teste Pink mostraram uma sensibilidade comparável (95% e 91%). A sensibilidade dos testes de fragilidade osmótica NaCl, comumente considerado o padrão ouro para o diagnóstico de esferocitose hereditária, foi de 68% no sangue fresco e 81% no sangue incubado, e diminuiu ainda mais nos casos compensados (53% e 64%, respectivamente). A combinação do teste de ligação eosina-5′-maleimida e do teste de lise com glicerol acidificado permitiu identificar todos os pacientes com esferocitose hereditária. O teste de ligação eosina-5′-maleimida mostrou a maior especificidade da doença. Conclusões Cada tipo de teste falha no diagnóstico de alguns casos de esferocitose hereditária. A associação de um teste de ligação eosina-5′-maleimida e um teste de lise com glicerol acidificado permitiu identificar todos os pacientes com esferocitose hereditária nesta série e, portanto, representa uma estratégia de diagnóstico atualmente eficaz para a esferocitose hereditária, incluindo casos leves/compensados.

Introdução

A esferocitose hereditária é a anemia hemolítica congênita mais comum em caucasianos, afetando aproximadamente 1 em 1000-2000 indivíduos.1,2 O defeito molecular é altamente heterogêneo envolvendo os genes que codificam a espectrina, anquirina, banda 3 e proteína 4,2,3 e o grau de hemólise varia muito, desde a anemia totalmente compensada até a anemia transfusional.

A marca típica de laboratório da esferocitose hereditária, embora não específica, é a presença de esferócitos em um esfregaço de sangue periférico, que são detectáveis em 97% dos pacientes.4 Contudo, pode haver muito poucos esferócitos em alguns pacientes4,5 e, portanto, são necessários operadores qualificados para detectá-los; além disso, o exame microscópico dos eritrócitos é cada vez mais omitido na era da automação laboratorial. O diagnóstico laboratorial da esferocitose hereditária depende, portanto, comumente de exames que exploram a relação área-volume superficial, tipicamente reduzida em eritrócitos esféricos, em particular testes de fragilidade osmótica de eritrócitos em várias concentrações de cloreto de sódio (NaCl) em sangue fresco e incubado,6 e ensaios que medem a extensão ou a taxa de lise de eritrócitos suspensos em soluções tampão de glicerol, i.e. o teste de lise com glicerol (GLT),7 o teste de lise com glicerol acidificado (AGLT)8 e o teste Pink.9 Entretanto, estes testes não detectam uma proporção variável de casos de esferocitose hereditária, particularmente os mais leves,6,10-12 e não diferenciam a esferocitose hereditária da esferocitose secundária associada a outras condições, principalmente anemias hemolíticas auto-imunes.13-Mais recentemente, o teste de criohemólise,16,17 baseado na observação de que os eritrócitos de pacientes com esferocitose hereditária são particularmente suscetíveis ao resfriamento a 0° C em condições hipertônicas, e a análise citométrica de fluxo de eritrócitos intactos marcados com eosina-5′-maleimida (teste de ligação EMA)18 foram propostos como novos métodos para identificar a esferocitose hereditária.19 Este último, em particular, provou ser um teste diagnóstico sensível e específico para a esferocitose hereditária12,18,20-29, visando diretamente a lesão estrutural desta doença, uma vez que a sonda fluorescente, eosina-5′-maleimida, interage com o complexo da banda proteica 3.30

A realização dos testes diagnósticos diretos ou indiretos disponíveis tem sido avaliada, em sua maioria, individualmente e em número limitado de casos. A sensibilidade do teste varia muito e cada método não consegue identificar vários pacientes com esferocitose hereditária.4,6,12 Neste estudo, comparamos os desempenhos da fragilidade osmótica induzida por EMA, de sangue fresco e incubado, GLT, AGLT e Pink em uma série de 150 pacientes com esferocitose hereditária agrupados de acordo com o fenótipo clínico e lesão molecular, com o objetivo final de encontrar a combinação de testes associados ao maior poder diagnóstico para esferocitose hereditária, incluindo os casos mais leves, geralmente difíceis de diagnosticar.

Design and Methods

Subjects

Cento e cinquenta pacientes consecutivos com esferocitose hereditária (79 homens e 71 mulheres, mediana de idade 26 anos, variação de 0-79 anos) pertencentes a 128 famílias não relacionadas. Na época do estudo, 22 pacientes foram esplenectomizados e 128 não esplenectomizados.

Ferocitose hereditária foi diagnosticada com base em sinais clínicos e laboratoriais de hemólise crônica, presença de esferócitos no exame de esfregaço de sangue periférico, positividade de pelo menos um teste de fragilidade de eritrócitos, história familiar de esferocitose hereditária, se houver, e exclusão de outras causas de esferocitose secundária.19 Anemia foi definida como grave (Hb<8 g/dL), moderada (Hb 8-10 g/dL), leve (Hb>10 e <11,5 g/dL para fêmeas e Hb>10 e <13,5 g/dL para machos) e compensada (Hb>11,5 g/dL para fêmeas e >13,5 g/dL para machos).

Amostras de todos os pacientes foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida sódica (SDS-PAGE) para análise das proteínas da membrana dos eritrócitos e divididas de acordo com a deficiência de banda 3, espectrina ou anquirina, deficiência combinada de espectrina/anquirina e nenhum defeito detectável.4

Cincocentos e setenta e cinco doadores de sangue saudáveis e 84 casos com anemia hemolítica que não a esferocitose hereditária (17 com anemia hemolítica auto-imune, 10 com distúrbios das enzimas dos eritrócitos), 10 com eliptocitose hereditária, 15 com anemia diseritropoiética congénita, 9 com hemoglobinúria paroxística nocturna, 3 com estomatocitose, 3 com anemia mecânica e 17 com anemia de causa desconhecida) também foram estudados.

Avaliações hematológicas

Sangue periférico foi coletado de pacientes e controles durante procedimentos diagnósticos após obtenção do consentimento informado e aprovação do Comitê Institucional de Pesquisa em Humanos. Os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos internacionais de Helsinki sobre experimentação humana. A grande maioria das amostras foi coletada em nosso instituto; as amostras coletadas em outros centros foram enviadas mantendo uma temperatura de 4°C e sempre processadas em 24 h. Todos os testes foram realizados em um único local. Nenhum dos pacientes tinha sido transfundido nos 3 meses que antecederam o estudo. Os parâmetros hematológicos foram determinados em um analisador hematológico automático (Beckman Coulter automático LH-750, CA, EUA). Investigações hematológicas de rotina foram realizadas de acordo com Dacie & Lewis.32 Os níveis de bilirrubina, haptoglobina e ferritina foram determinados usando Integra 800 (Roche, Mannheim, Alemanha). O número de esferócitos no sangue periférico foi avaliado por dois operadores independentes e especializados. A fragilidade osmótica dos eritrócitos foi avaliada pela realização do teste de fragilidade osmótica NaCl tanto no sangue fresco quanto no incubado,6 o GLT padrão,7 o AGLT8 e o teste Pink9 em amostras de cada paciente.

O teste de ligação EMA foi realizado como descrito por King et al.18 com pequenas modificações. Em particular, a intensidade de fluorescência, expressa como fluorescência de canal mediano, foi determinada para 10.000 eventos no canal FL-1, usando um citômetro de fluxo Becton Dickinson FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). A solução de estoque de corante EMA foi armazenada em pequenas alíquotas a -80° C durante um período de 6 meses. O teste foi realizado uma vez por semana agrupando todos os casos no mesmo dia25 após confirmar a reprodutibilidade dos resultados em amostras de sangue armazenadas até 6 dias a 4°C.

A fim de diminuir a variação intra-ensaio, as amostras dos pacientes foram comparadas com as dos seis controles normais. Os resultados foram expressos como a porcentagem de redução da fluorescência da amostra do paciente em relação à fluorescência média dos seis controles normais, conforme proposto por Girodon et al.25 Uma curva de característica operacional do receptor (ROC) baseada na análise de regressão logística foi utilizada para determinar o corte ótimo entre os valores de pacientes com esferocitose hereditária e os de indivíduos normais. De acordo com a análise da curva ROC, a diminuição ótima da fluorescência para separar indivíduos normais de pacientes com esferocitose hereditária foi de 11%. Nessas condições, a especificidade do teste calculado em 575 indivíduos saudáveis foi de 98%.

Fantasmas de células vermelhas foram preparados dentro de 24 h após a coleta de sangue, usando o método descrito por Dodge et al.33 com ligeiras modificações.4 As proteínas da membrana de células vermelhas foram analisadas dentro de 15 dias após a preparação do fantasma pela SDS-PAGE, usando um gradiente de 4% a 12% de acrilamida de acordo com Fairbanks et al.34 e o sistema tampão descontínuo de Laemmli35 com um gradiente linear de acrilamida de 6% a 14%, como descrito anteriormente.4 As atividades das enzimas das vias glicolíticas e pentose fosfática foram testadas pelos métodos descritos por Beutler.36

Resultados

Quadro 1 mostra os dados hematológicos e bioquímicos dos pacientes com esferocitose hereditária agrupados de acordo com se não tinham sido esplenectomizados ou tinham sido esplenectomizados antes do momento do estudo e de acordo com o fenótipo clínico (apenas em pacientes não esplenectomizados). A maioria dos indivíduos não esplenectomizados apresentava hemólise leve a compensada; 18% tinham muito poucos esferócitos (≤3%). As anomalias proteicas mais comuns foram as deficiências de espectrina e da banda 3, tanto em pacientes não esplenectomizados quanto em pacientes esplenectomizados. O defeito proteico da membrana era indetectável em nove (7%) indivíduos não esplenectomizados, sete dos quais tinham história familiar positiva de esferocitose hereditária; os dois restantes apresentavam anemia leve, reticulocitose e 5% de esferócitos, na ausência de outras causas de anemia hemolítica crônica.

Tabela 2 compara a sensibilidade dos testes laboratoriais diagnósticos para esferocitose hereditária. A ligação da EMA falhou em identificar 10/150 (7%) casos (4 com deficiência da banda 3, 5 com deficiência de espectrina e 1 com um defeito não detectado). A diminuição média da fluorescência foi de 27% ± 10% em pacientes com esferocitose hereditária versus 0 % ± 8% em indivíduos de referência (P<0,001). A redução percentual da fluorescência esteve diretamente relacionada com o número de esferócitos e indiretamente com o volume corpuscular médio; não foi encontrada correlação com a concentração de hemoglobina, número absoluto de reticulócitos ou largura de distribuição de eritrócitos. A sensibilidade do teste foi independente do tipo e quantidade de defeito molecular, embora tenha sido ligeiramente menor em pacientes com defeitos não detectados que tiveram a menor diminuição mediana da fluorescência (15% versus 30% e 28% na banda 3 e deficiência de espectrina, respectivamente). Vale ressaltar que a sensibilidade do teste de ligação EMA foi ligeiramente maior em pacientes esplenectomizados do que em não esplenectomizados (Figura 1).

A sensibilidade dos vários ensaios de fragilidade dos eritrócitos investigados foi muito variável e geralmente maior em esplenectomizados do que em esferocitose hereditária não esplenectomizada, e menor (com exceção do AGLT) nos pacientes com defeitos não detectados do que naqueles com defeitos detectáveis (Tabela 2A). Quanto ao teste de fragilidade osmótica de NaCl, a sensibilidade foi maior quando realizado em sangue incubado do que em sangue fresco. Em geral, as provas de fragilidade osmótica de NaCl (tanto em sangue fresco como em sangue incubado) tiveram uma sensibilidade menor do que as provas mais comumente utilizadas à base de glicerol. Entre estes últimos ensaios, o AGLT teve a maior sensibilidade, também nos casos com defeitos não detectados, comparável à do teste de ligação EMA.

Table 1.Dados hematológicos e bioquímicos de pacientes com esferocitose hereditária agrupados de acordo com se tinham ou não sido esplenectomizados.

Todos os pacientes com esferocitose hereditária foram positivos a pelo menos dois testes diferentes, com exceção de dois pacientes (1 com deficiência da banda 3 e 1 com deficiência de espectrina) que foram positivos apenas no teste de ligação EMA. Verificamos que a combinação de EMA e AGLT permitiu identificar todos os pacientes com esferocitose hereditária (Tabela 2B). Em particular, 133/150 (88%) dos casos de esferocitose hereditária foram EMA positivo, AGLT positivo, 7/150 (5%) foram EMA positivo, AGLT negativo e 10/150 (7%) foram EMA negativo e AGLT positivo.

Quando a realização dos vários testes foi analisada em pacientes não esplenectomizados em função do fenótipo clínico, o teste de ligação à EMA, o AGLT e o teste Pink mantiveram alta sensibilidade nos diferentes subgrupos clínicos, enquanto a sensibilidade do teste de fragilidade osmótica de NaCl no sangue fresco e após a incubação caiu acentuadamente nos casos compensados (Figura 1).

Os resultados de vários testes em uma série de 84 pacientes com condições hemolíticas diferentes da esferocitose hereditária estão representados na Figura 2. A ligação EMA mostrou a maior especificidade da doença sendo negativa em todos os pacientes com anemia hemolítica auto-imune, mesmo na presença de esferocitose marcada.

Discussão

Este é o primeiro estudo comparativo extensivo dos métodos laboratoriais mais utilizados atualmente para o diagnóstico da esferocitose hereditária, realizado em um grande número de pacientes agrupados de acordo com o defeito molecular, o grau de hemólise e a presença ou ausência do baço. A constatação de que metade dos pacientes examinados tinha anemia leve/compensada e, portanto, mais difícil de diagnosticar, e que 18% tinham muito poucos esferócitos no esfregaço de sangue periférico, torna a população examinada particularmente adequada para estudos de sensibilidade. Não incluímos o teste de criohemólise17 neste estudo, pois a base da suscetibilidade da esferocitose hereditária ao resfriamento ainda não foi elucidada e as opiniões sobre sua utilização rotineira para o diagnóstico de esferocitose hereditária são controversas.4,5,16,17,19,37,38

Tabela 2.(A) Sensibilidade de testes únicos em pacientes com esferocitose hereditária (SH) agrupados de acordo com o defeito bioquímico. (B) A sensibilidade de testes combinados em casos de HS total. O número representa a relação de casos positivos/total de casos com valores percentuais entre parênteses.

Figure 1.Sensibilidade de vários testes diagnósticos em 22 pacientes esplenectomizados e 128 pacientes não esplenectomizados com esferocitose hereditária (SH). Os pacientes não esplenectomizados com SH foram divididos de acordo com o fenótipo clínico.

Dentre os métodos diagnósticos considerados, o teste de ligação EMA recentemente proposto é certamente o mais interessante, e está sendo cada vez mais utilizado por laboratórios especializados devido à sua alta sensibilidade e especificidade.12,18,23-29 Este método visa diretamente a lesão estrutural da doença, pois a sonda fluorescente eosina-5′-maleimida interage com as proteínas transmembrana banda 3, Rh protein, Rh glycoprotein e CD47 que são reduzidas em eritrócitos de pacientes com esferocitose hereditária;30 defeitos de outras proteínas citoesqueléticas, como a espectrina e a proteína 4.2, também induzem uma diminuição na intensidade de fluorescência, provavelmente porque criam um efeito de modulação de longo alcance sobre o local de ligação do corante na proteína da banda 3.39 A sensibilidade do teste de ligação da EMA nesta série é maior do que a recentemente relatada por Crisp et al.,12 e semelhante à encontrada por outros;18,23-29 além disso, o desempenho do teste parece ser independente do tipo de deficiência de proteína da membrana dos eritrócitos, e diminui apenas ligeiramente em pacientes com esferocitose hereditária com defeito indetectável, em linha com o observado por King et al.,18 e Girodon et al.25 Curiosamente, a sensibilidade é independente do fenótipo clínico, sendo alta também em pacientes com anemia compensada. A análise separada de pacientes não esplenectomizados e esplenectomizados com esferocitose hereditária mostrou que a sensibilidade aumentou neste último grupo, um achado geralmente comum a todos os testes investigados; esta observação aponta para a necessidade de definir com precisão as características clínicas dos pacientes ao testar o desempenho dos métodos diagnósticos para esferocitose hereditária, e possivelmente limitar a análise a sujeitos não esplenectomizados. Uma outra vantagem do teste de ligação EMA é que os resultados não são influenciados pelo envio ou armazenamento por até 6 dias, como mostrado na Figura 3, permitindo assim o envio de amostras como relatado por Girodon et al.25 Além disso, os resultados não são afetados por transfusões recentes, pois o método discrimina diferentes populações de eritrócitos.20

Figure 2.Results of individual diagnostic tests in patients with hemolytic anemias other than hereditary spherocytosis (HS), compared with those with HS. A área sombreada representa intervalos normais de referência. CDA: anemia diseritropoiética congênita; AIHA: anemia hemolítica auto-imune; HE: eliptocitose hereditária; PNH: hemoglobinúria paroxística noctural

No que diz respeito aos testes de fragilidade osmótica do NaCl, constatamos que estes não identificaram quase um quarto dos pacientes com esferocitose hereditária, confirmando resultados de outros pesquisadores,12,13,19,40,41 e que sua sensibilidade foi geralmente menor do que a dos outros testes laboratoriais diagnósticos avaliados nesta série. Apesar disso, a fragilidade osmótica incubada de NaCl ainda é comumente considerada o padrão ouro para o diagnóstico da esferocitose hereditária em pacientes com anemias hemolíticas negativas de Coombs.5,11,42 De fato, a análise da literatura revela que não foram realizados estudos sistemáticos sobre a sensibilidade deste teste no passado e que a afirmação de que é o melhor método para o diagnóstico da esferocitose hereditária se baseia em estudos realizados em número limitado de pacientes com características clínicas não claramente definidas; além disso, a interpretação das curvas de fragilidade osmótica do NaCl pode ser difícil em casos menos típicos.8 O elevado número de pacientes considerados nesta série permitiu correlacionar a realização da prova de fragilidade osmótica de NaCl com a expressão clínica da doença: a observação de que nos casos de esferocitose hereditária compensada a sensibilidade das provas de fragilidade osmótica diminuiu para quase 60%, muito mais do que o relatado por Korones & Pearson13 , limita ainda mais a utilidade deste método nos casos mais leves e menos típicos. Isto também é confirmado pelo achado de que a sensibilidade cai para 30% em pacientes com esferocitose hereditária com defeito bioquímico indetectável.

Os testes de fragilidade dos glóbulos vermelhos baseados em glicerol, com exceção da versão original GLT, são mais sensíveis que o teste de fragilidade osmótica NaCl; em particular, nesta série, o AGLT teve uma sensibilidade de 95%, semelhante à encontrada por outros1,15,43,44 e maior que a relatada por Cynober et al.10 e Bucx et al.45 A sensibilidade do AGLT também foi alta nos casos compensados e naqueles com defeito bioquímico não detectado. Além disso, vale ressaltar que o AGLT identificou os dez casos EMA-negativos de esferocitose hereditária.

A associação de ligação EMA e AGLT permitiu identificar todos os casos de esferocitose hereditária desta série; como o citômetro de fluxo não está disponível em todos os laboratórios de diagnóstico, vale mencionar que o AGLT mais o teste de fragilidade osmótica de NaCl no sangue incubado eleva a sensibilidade diagnóstica para 97%, semelhante ao anteriormente relatado em uma série maior de pacientes4: em qualquer caso, este valor é superior ao obtido pela combinação da ligação EMA com o teste de criohemólise, como recentemente relatado por Crisp et al.12

Figure 3.(A) Valores médios de fluorescência de canal em controles normais e pacientes com esferocitose hereditária (SH) em diferentes dias de armazenamento. (B-C) Resultados do teste de ligação EMA em amostras de 150 pacientes HS agrupados de acordo com o envio (B) e dias de armazenamento antes do teste (C). ■ Controles, – HS não enviado, ○ HS enviado.

Figure 4.Flow chart para diagnóstico laboratorial da esferocitose hereditária (HS).

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A especificidade da doença dos testes diagnósticos para esferocitose hereditária foi avaliada incluindo um grande grupo de pacientes com diferentes tipos de anemia hemolítica que podem apresentar características morfológicas e laboratoriais semelhantes às da esferocitose hereditária. Como esperado, os resultados da ligação EMA, em termos de percentagem de redução da fluorescência, foram directamente relacionados com o número de esferócitos apenas em doentes com esferocitose hereditária, mas não em doentes com anemia hemolítica auto-imune, mesmo naqueles com esferocitose marcada: esta observação está de acordo com a elevada especificidade da doença deste teste relatada por outros.19-21,25 Verificamos que os outros ensaios, em particular os baseados em glicerol, são menos específicos do que os de EMA, pois, como relatado anteriormente,8,9,14,15,46 são frequentemente positivos também nas anemias hemolíticas adquiridas. Vale ressaltar que nenhum dos testes diagnósticos disponíveis para esferocitose hereditária, seja direta ou indireta, diferencia a esferocitose hereditária da anemia diseritropoiética congênita tipo II. Esta última desordem, embora menos prevalente que a esferocitose hereditária, pode imitar a apresentação clínica, a morfologia dos eritrócitos e o aumento da fragilidade osmótica dos eritrócitos e pode requerer a análise SDS-PAGE para ser identificada: Mariani et al. relataram que 13% dos casos encaminhados para um laboratório de referência com o rótulo provisório de esferocitose hereditária foram encontrados como anemia diseritropoiética congênita tipo II quando examinados pela SDS-PAGE.47

As diretrizes diagnósticas para esferocitose hereditária do Comitê Britânico de Padrões em Hematologia,19 o único disponível até o momento, recomendam a ligação por EMA ou o teste de criohemólise como método de triagem,16 o fator decisivo para a escolha é a disponibilidade de um citômetro de fluxo. As diretrizes não especificam se, no caso de resultados equívocos ou limítrofes, ambos os testes devem ser realizados. Em qualquer caso, mesmo a associação destes dois testes dá uma sensibilidade de 93%, semelhante à do EMA-binding ou AGLT usado isoladamente, e muito inferior à obtida pela combinação de EMA-binding mais AGLT.

Como visto na Figura 4, na presença de um paciente com hemólise crónica negativa ao teste DAT com esferócitos, a negatividade tanto do EMA como do AGLT permite excluir a esferocitose hereditária. A positividade da ligação EMA (com AGLT positiva ou negativa) leva ao diagnóstico de esferocitose hereditária, exceto nos casos não dominantes com reticulocitose inadequada11 que necessitam de análise SDS-PAGE para excluir anemia diseritropoiética congênita tipo II. A análise SDS-PAGE também pode ser necessária nos raros casos de esferocitose hereditária negativa, com história familiar negativa, devido à menor especificidade da AGLT.

Em conclusão, nenhum teste é capaz de identificar todos os casos de esferocitose hereditária. A associação de EMA-binding, que visa diretamente o defeito estrutural da esferocitose hereditária, e AGLT, que explora a relação área-volume da superfície dos eritrócitos, nos permitiu identificar todos os pacientes com esferocitose hereditária nesta série e, portanto, representa uma estratégia diagnóstica muito eficaz para a esferocitose hereditária também em casos leves/compensados. No entanto, é necessário sublinhar que o diagnóstico da esferocitose hereditária é a etapa final de um trabalho de diagnóstico baseado não só em testes laboratoriais mas também no exame clínico, na história familiar pessoal e na exclusão de possíveis causas de esferocitose secundária.

Footnotes

• Funding: este trabalho foi apoiado por um subsídio da Fundação IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico de Milão, RC2009 160/01 e projecto ENERCA III, EC 2008, convenção n. 210.
• Autoria e Divulgação A informação fornecida pelos autores sobre contribuições de pessoas listadas como autores e em agradecimentos está disponível com o texto completo deste artigo em www.haematologica.org.
• Finanças e outras divulgações fornecidas pelos autores usando o ICMJE (www.icmje.org) Formato Uniforme para Divulgação de Interesses Concorrentes também estão disponíveis em www.haematologica.org.

• Recebido em 4 de agosto de 2011.
• Revisão recebida em 11 de outubro de 2011.
• Recebida em 26 de outubro de 2011.

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