Desde que a quantificação precisa das proteínas é essencial para todas as experiências relacionadas com os estudos proteicos, foram desenvolvidos diferentes métodos para medir a concentração de proteínas em um determinado ensaio. Alguns dos métodos mais tradicionais de quantificação de proteínas totais incluem a medição da absorvância UV a 280 nm (A280), ensaios de ácido Bicinchonínico (BCA) e Bradford, e outros métodos alternativos como Lowry e outros ensaios novos.
Desde que as proteínas absorvem luz num comprimento de onda específico, a medição pode ser obtida utilizando um espectrofotómetro. Especificamente, os aminoácidos tirosina e triptofano têm uma absorção muito específica a 280 nm, permitindo a medição direta da concentração de proteína A280.
Absorv absorvância a 280 nm é rotineiramente utilizada para estimar a concentração de proteína em laboratórios devido à sua simplicidade, facilidade de uso e acessibilidade. As medições são rápidas e altamente reprodutíveis, uma vez que não há necessidade de incubação. Além disso, este método também requer um volume de amostra extremamente pequeno já que os espectrofotômetros modernos utilizam um sistema de retenção de amostra durante a medição.
No entanto, deve-se ter cuidado para garantir que a amostra de proteína não contenha nenhum componente não protéico (por exemplo, ácidos nucléicos) com o mesmo espectro de absorção já que pode levar a resultados errôneos. Para além da determinação das concentrações proteicas, os valores de absorvância também podem ser utilizados na detecção de alterações conformacionais e ligação ligante e para o seguimento de reacções enzimáticas.
O efeito do triptofano e da tirosina na quantidade de proteínas
Devem ser tidos em conta a presença de tirosina e triptofano, proteínas e péptidos contendo estes aminoácidos aromáticos absorvem a luz UV a um comprimento de onda de 280 nm. Cada um destes resíduos tem diferentes comprimentos de onda de absorção e emissão e varia no rendimento quântico. As ligações fenilalanina e dissulfeto também contribuem para a absorção neste comprimento de onda, mas como é relativamente insignificante, só pode ser observado na ausência de triptofano e tirosina.
Muitos cofactores enzimáticos contendo estruturas de anéis aromáticos (por exemplo, FMN, FAD, NAD e porfirinas) também absorvem a luz UV para excitação e, portanto, aumentam a intensidade da fluorescência resultante. Proteínas especiais como a Proteína Fluorescente Verde também têm uma sequência interna de serinetyrosina-glicina que é modificada pós-tradução e é fluorescente na região da luz visível.
Tryptophan
Tryptophan é significativamente mais fluorescente que a tirosina e a fenilalanina. Entretanto, suas propriedades fluorescentes são dependentes do solvente, ou seja, o espectro muda para comprimentos de onda mais curtos e aumenta de intensidade à medida que a polaridade do solvente diminui. Como tal, os resíduos de triptofano enterrados em domínios hidrofóbicos de proteínas dobradas apresentam um deslocamento espectral de 10 a 20 nm.
Devem à sua maior absorvência, maior rendimento quântico e transferência de energia de ressonância, o espectro de fluorescência de uma proteína contendo os três aminoácidos geralmente se assemelha ao do triptofano.
Tirosina
Tirosina pode ser excitada em comprimentos de onda similares aos do triptofano, mas emitirá em um comprimento de onda distintamente diferente. Embora possa ser verdade que a tirosina é menos fluorescente que o triptofano, ela pode fornecer um sinal significativo, uma vez que muitas vezes está presente em grandes números em muitas proteínas. A fluorescência da tirosina tem sido observada para ser atenuada pela presença de peptídeos triptofanos próximos através da transferência de energia de ressonância ou da ionização de seu grupo hidroxila aromática.
Aqui estão alguns pontos importantes a serem lembrados ao medir peptídeos usando o método A280.
- Proteínas de peso molecular semelhante podem ter diferentes valores de absorvância devido à diferença no conteúdo de triptofano e tirosina.
- A absorvância do VU também é afectada pela estrutura da proteína. Assim, condições que afetam a estrutura (tais como temperatura, pH, força iônica ou a presença de detergentes) podem afetar a capacidade dos resíduos aromáticos de absorver luz a 280 nm, e alterar o valor do coeficiente de extinção da proteína.
- O ambiente local dos aminoácidos aromáticos pode ter um efeito em seus espectros. Isto significa que o triptofano terá um pico de emissão em comprimentos de onda mais baixos quando enterrado dentro das regiões hidrofóbicas internas de uma proteína, enquanto que a tirosina freqüentemente transferirá sua energia para os aminoácidos triptofanos adjacentes. O tirosinato ionizado, que se forma quando os prótons são perdidos da tirosina como resultado do aumento do pH, demonstrará comprimentos de onda similares ao triptofano.