Produção eficiente de ácido 3-hidroxipropiônico a partir de glicerol por Klebsiella pneumoniae projetada metabometricamente

Na produção de 1,3-propanodiol ou 3-HP a partir de glicerol, o ácido láctico é o principal subproduto que reduz significativamente o rendimento do produto. Portanto, foram feitas tentativas para reduzir a produção de lactato através da eliminação do gene que codifica a desidrogenase láctica (Kumar et al. 2013b; Zhong et al. 2014). Como ambas as reacções que formam 1,3-propanodiol e 3-HP competem pelo seu substrato comum 3-hidroxialdeído (3-HPA), a eliminação da propanodiol oxidoreductase favorece a produção de 3-HP (Ashok et al. 2011). Portanto, neste estudo, os genes ldhA e dhaT foram eliminados para aumentar a produção de 3-HP.

Efeito da deficiência de ldhA na produção de 3-HP

A estirpe deficiente de ldhA JJQ01 foi construída e a eliminação de ldhA foi confirmada como mostrado na Figura S2A. As cepas recombinantes Kp4(pUC18-kan-aldH) e JJQ01(pUC18-kan-aldH) foram construídas e as fermentações em lote foram realizadas no biorreator 5-L. Os perfis de crescimento celular, consumo de glicerol e produção de metabólitos são mostrados na Fig. 2a, b. Kp4(pUC18-kan-aldH) produziu 18,3 g/L de 3-HP com um rendimento de 0,21 mol/mol em 38 h, enquanto o ácido láctico atingiu 32,2 g/L com um rendimento maior de 0,34 mol/mol. Além disso, foram produzidos 17,6 g/L de 2,3-butanodiol, 6,1 g/L de 1,3-propanodiol e 10,7 g/L de ácido acético. A formação de lactato aumenta não só o custo, mas também a dificuldade de recuperação do 3-HP, que é um isômero do lactato. Além disso, o lactato é um inibidor principal da biossíntese de 3-HP e 1,3-propanodiol (Xu et al. 2009b; Kumar et al. 2013b). A deficiência de ldhA eliminou efetivamente a formação de lactato e a produção de 3-HP alcançou 48,3 g/L com um rendimento de 0,28 mol/mol, como mostrado na Fig. 2b. A concentração e rendimento do 3-HP nesta cepa deficiente de ldhA foram aumentados em 1,64 vezes e 33,3%, respectivamente, em comparação com a cepa Kp4(pUC18-kan-aldH). Com exceção da pequena quantidade de formação de etanol (cerca de 4 g/L), o acúmulo de piruvato e formação pela cepa mutante ldhA não foi detectado, o que quase não foi observado no caso do uso da cepa do tipo selvagem.

Estes resultados indicam claramente que o bloqueio da produção de ácido láctico redireccionou grandemente o fluxo de carbono para a produção de 3-HP. A assimilação do glicerol através do DhaB foi significativamente melhorada, quase 0,4 mol/mol de glicerol foi dirigido através do DhaB para o 3-HPA, o que foi consistente com outros estudos (Kumar et al. 2013b; Xu et al. 2009b). A redução do lactato poderia diminuir a toxicidade às células, favorecendo o crescimento celular e a produtividade do 3-HP. Entretanto, a redução do lactato também aumentou a formação de 2,3-butanodiol e 1,3-propanodiol, que alcançaram 21,9 g/L com um rendimento de 0,13 mol/mol e 18,5 g/L com um rendimento de 0,12 mol/mol, respectivamente. Devido à eliminação do ldhA, o excesso de NADH derivado da acumulação aumentada de 3-HP pode promover a produção de 2,3-butanodiol e 1,3-propanodiol em vez de lactato para regenerar o NAD+ e manter o equilíbrio redox. De fato, a formação de etanol também apoiou a regeneração do NAD+, que resultou em maior fluxo de piruvato para etanol do que o fluxo para piruvato.

Efeito da deficiência de dhaT na produção de 3-HP

A eliminação do ldhA aumentou drasticamente a produção de 3-HP, ao mesmo tempo em que a produção de 1,3-propanodiol também foi aumentada para 18,5 g/L. Ko et al. (2017) relataram que 43 g/L de 3-HP e 21 g/L de 1,3-propanodiol foram obtidos pela redução do acetato e outros subprodutos. Embora a formação de 1,3-propanodiol beneficie a utilização de glicerol através da regeneração do co-fator, ele é responsável por uma porção substancial do fluxo de carbono de glicerol. Como o 1,3-propanodiol e o 3-HP competem pelo mesmo precursor 3-HPA, para limitar o fluxo ao 1,3-propanodiol, foi construída a estirpe ldhA e dhaT double-knockout (mostrada no arquivo adicional 1: Figura S2B) JJQ02(pUC18-kan-aldH). Os resultados da fermentação dos lotes alimentados no reator 5-L são mostrados na Fig. 2c. Inesperadamente, a concomitância de ldhA e dhaT knockout resultou em apenas 44,5 g/L de 3-HP, embora o rendimento tenha sido aumentado para 0,32 mol/mol glicerol. A eliminação do dhaT resultou na redução do título de 1,3-propanodiol e do rendimento para 9,9 g/L e 0,07 mol/mol, respectivamente. Mas 1,3-propanodiol ainda foi produzido na reação catalisada pela YqhD e outra oxidoreductase (Ashok et al. 2013). Além disso, comparado ao JJQ01(pUC18-kan-aldH), a produção de 2,3-butanodiol foi aumentada de 21,9 para 23,4 g/L ligeiramente, indicando que o fluxo para a via do 2,3-butanodiol foi aumentado para consumir o excesso de NADH derivado da reação catalisada pela ALDH. A síntese do 1,3-propanodiol tem um papel fundamental na regulação do balanço redox em K. pneumoniae. Dentro da via de oxidação, a formação de uma molécula de acetato a partir do glicerol produz três moléculas de NADH, ao mesmo tempo em que se forma uma molécula de ATP. Consequentemente, a eliminação tanto do ldhA como do dhaT reduziu muito a capacidade de regeneração do NAD+, e mais NADH foi oxidado através da formação de 2,3-butanodiol, resultando no aumento de 2,3-butanodiol. A redução da taxa de aeração (limitando o suprimento de oxigênio) poderia aumentar a produção de acetato para fornecer mais ATP, mas ao mesmo tempo mais NADH foi formado, resultando em um aumento adicional da produção de 2,3-butanodiol. Entretanto, o NAD+ regenerado parecia ser menor do que o formado na reação catalisada pelo DhaT, levando a uma menor produção de 3-HP. Portanto, o suprimento de quantidade adequada de oxigênio para gerar NAD+ sem afetar a atividade de DhaB e dissimilação de glicerol é crítico para a produção de 3-HP na fermentação microaeróbica.

Neste estudo, falhou em melhorar a produção de 3-HP pela deleção do gene dhaT. A dissimilação do glicerol é regulada pela glicerol desidrogenase DhaD, glicerol quinase GlpK, glicerol desidratase DhaB e 1,3-propanodiol oxidoreductases 1,3-PDORs. A rigidez do ponto do ramo glicerol implica que é difícil melhorar a produção de 3-HP através da eliminação dos genes envolvidos na partição do fluxo de glicerol. Ashok et al. (2011) haviam determinado as atividades inerentes ao DhaD, DhaB, ALDH e 1,3-PDORs após a deleção do gene dhaT. Eles descobriram que a atividade do DhaD foi ligeiramente melhorada, a atividade do ALDH ligeiramente diminuída, e a atividade do DhaB significativamente diminuída. Zhang et al. (2008) também analisaram a robustez nos pontos de ramificação da via de dissimilação do glicerol. Foi demonstrado que a partição do fluxo de carbono entre o ramo redutor e o ramo oxidativo foi robusta contra as condições ambientais.

Efeito da aeração na produção de 3-HP

Nossos estudos anteriores mostraram que a condição microaeróbica era favorável à produção de 3-HP. Em comparação ao processo anaeróbio, na fermentação microaeróbia a produção de 3-HP foi significativamente aumentada devido ao maior nível de expressão de aldeído desidrogenase e, ao mesmo tempo, a produção de 1,3-propanodiol foi reduzida (Huang et al. 2013). Wang et al. (2011) relataram que a atividade específica de glicerol desidratase em K. pneumoniae a uma taxa de aeração de 0,04 vvm foi 59% maior do que na ausência de fornecimento de ar. Mas, tem sido relatado que a glicerol desidratase pode ser rapidamente inativada pelo oxigênio (Toraya 2000; Ruch e Lin 1975), e afetou significativamente a produção de 3-HP (Xu et al. 2009a; Huang et al. 2013; Niu et al. 2017). Além disso, a coenzima B12, cofactor do DhaB, não está suficientemente sintetizada sob condições de alta aeração na maioria dos produtores naturais de 3-HPA, como K. pneumoniae. Huang et al. (2013) e Ko et al. (2017) também mostraram que condições altamente aeróbicas não eram benéficas para a produção de 3-HPA. Portanto, realizamos experimentos preliminares em lotes alimentados sob diferentes condições de aeração e também descobrimos que manter uma alta taxa de aeração era desfavorável para a produção de 3-HP após o término do crescimento celular (dados não mostrados). Na cultura fed-batch do JJQ02(pUC18-kan-aldH), nós adotamos uma taxa de aeração metade da taxa inicial quando o OD650 foi fechado ao valor máximo. Os perfis de crescimento, glicerol e metabólitos são mostrados na Fig. 3, e a seta preta indicou o ponto de tempo para baixar a taxa de aeração (0,5 vvm).

O título final do 3-HP atingiu 61.9 g/L com um rendimento de 0,58 mol/mol no reator 5-L em 38 h. A concentração e rendimento do 3-HP pelo JJQ02(pUC18-kan-aldH) foram 3,3- e 2,76 vezes maiores que os do Kp4 (pUC18-kan-aldH), e 1,28- e 2,07 vezes maiores que os do JJQ01(pUC18-kan-aldH). Os resultados mostraram que a produção de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol parou às 20 h. Entretanto, o título de 3-HP continuou aumentando, embora a taxa de produção tenha diminuído a partir desse momento. Na parte final da fermentação microaeróbica, embora pouco NADH tenha sido regenerado através da formação de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol, algum NADH ainda pôde ser regenerado através da cadeia de transporte de electrões, pois a forma mais eficiente de regenerar o NADH+ é através da cadeia de transporte de electrões na presença de oxigénio (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b), resultando no aumento de 3-HP sem aumento óbvio de 1,3-propanodiol e 2,3-butanodiol.

300-L fermentação em escala

Para examinar a viabilidade da estirpe JJQ02(pUC18-kan-aldH) para produção de 3-HP em um biorreator maior, a fermentação em lote foi realizada em um biorreator de 300-L seguindo as condições de fermentação estabelecidas no fermentador de 5-L. A estratégia de aeração em dois estágios foi adotada; a taxa de aeração foi reduzida para metade no ponto de tempo da seta preta como mostrado na Fig. 4. O 3-HP atingiu 54,5 g/L com um rendimento de 0,43 mol/mol, e a concentração e rendimento foram de 12,2 g/L e 0,11 mol/mol para 1,3-propanodiol, 21,3 g/L e 0.17 mol/mol para 2,3-butanodiol, e 9,3 g/L e 0,11 mol/mol para acetato em 51 h (Fig. 4).

Comparado com os resultados obtidos no reator 5-L, o rendimento de 2,3-butanodiol e molar no reator 300-L foi obviamente aumentado, o que foi semelhante àqueles com a mesma tensão no reator 5-L a uma taxa de aeração constante de 1 vvm. Isso implicou que a transferência de oxigênio no reator 300-L pode ser um pouco maior que a do reator 5-L com taxa de aeração reduzida porque algumas pesquisas indicaram que a produção de 2,3-butanodiol requer taxa de aeração adequada (Cheng et al. 2004; Shi et al. 2014; Xu et al. 2014). Sob a condição de aeração no reator 300-L, a expressão das enzimas relacionadas com a formação de 2,3-butanodiol e a relação NADH ou NADH/NAD+ promoveu a produção de 2,3-butanodiol, e a expressão de DhaB e AldH pode ser ligeiramente afetada.

Com vista ao balanço redox, na cepa de duplo mutante ldhA dhaT, o NADH formado na reação catalisada pelo ALDH foi parcialmente regenerado pela formação de 2,3-butanodiol e outros metabólitos reduzidos, como etanol e succinato, e parcialmente pela cadeia de transporte de elétrons (Richardson 2000; Kumar et al. 2013b). Portanto, a taxa de aeração na fermentação por microaeração afetou significativamente os produtos finais. Na fermentação no reator 300-L, embora a taxa de aeração tenha sido reduzida para metade da inicial, a situação de transferência de oxigênio ainda pode diferir muito da do reator 5-L devido às diferentes características de transferência de oxigênio, que era um tópico tradicional no escalonamento do bioprocesso. As diferenças na distribuição de produtos em diferentes reatores indicavam a importância de um controle preciso do suprimento de oxigênio, enquanto que apenas a redução da taxa de aeração parecia ser muito aproximada. No entanto, embora o título e o rendimento do 3-HP diferissem ligeiramente dos do reator 5-L, o aumento de escala foi bem sucedido. Como o desempenho da transferência de oxigênio no reator 300-L foi diferente do do reator 5-L, esperava-se que uma regulação mais precisa da taxa de aeração no reator 300-L pudesse melhorar o nível de 3-HP.