Pyrosequencing é um método de sequenciamento de DNA (que determina a ordem dos nucleotídeos no DNA) baseado no princípio de “sequenciamento por síntese”, no qual o sequenciamento é realizado pela detecção do nucleotídeo incorporado por uma DNA polimerase. A sequência em pirose baseia-se na detecção da luz com base numa reacção em cadeia quando o pirofosfato é libertado. Assim, o nome pyrosequencing.
O princípio do Pyrosequencing foi descrito pela primeira vez em 1993 por Bertil Pettersson, Mathias Uhlen e Pål Nyren através da combinação do método de sequência de fase sólida usando contas magnéticas revestidas de estreptavidina com a polimerase de DNA recombinante sem actividade de 3’5’exonuclease (leitura de prova) e detecção de luminescência usando a enzima firefly luciferase. Uma mistura de três enzimas (DNA polimerase, ATP sulfurilase e firefly luciferase) e um nucleotídeo (dNTP) são adicionados ao DNA isolado a ser sequenciado e a incorporação do nucleotídeo é seguida pela medição da luz emitida. A intensidade da luz determina se 0, 1 ou mais nucleotídeos foram incorporados, mostrando assim quantos nucleotídeos complementares estão presentes no cordão modelo. A mistura de nucleotídeos é removida antes da próxima mistura de nucleotídeos ser adicionada. Este processo é repetido com cada um dos quatro nucleótidos até ser determinada a sequência de ADN do modelo de cadeia única.
Um segundo método baseado na solução de Pyrosequencing foi descrito em 1998 por Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen e Pål Nyren. Neste método alternativo, uma enzima adicional apyrase é introduzida para remover nucleotídeos que não são incorporados pela DNA polimerase. Isto permitiu que a mistura enzimática incluindo a DNA polimerase, a luciferase e a apyrase fosse adicionada no início e mantida durante todo o procedimento, proporcionando assim uma configuração simples e adequada para a automação. Um instrumento automatizado baseado neste princípio foi apresentado ao mercado no ano seguinte pela empresa Pyrosequencing.
Uma terceira variante microfluídica do método Pyrosequencing foi descrita em 2005 por Jonathan Rothberg e colaboradores da empresa 454 Life Sciences. Esta abordagem alternativa para o Pyrosequencing foi baseada no princípio original de fixar o DNA a ser sequenciado a um suporte sólido e eles mostraram que o sequenciamento poderia ser realizado de forma altamente paralela usando um microarranjo microfabricado. Isto permitiu um sequenciamento de DNA de alto rendimento e um instrumento automatizado foi introduzido no mercado. Este tornou-se o primeiro instrumento de sequenciamento da próxima geração a iniciar uma nova era na pesquisa genómica, com preços em queda rápida para o sequenciamento de ADN permitindo o sequenciamento de todo o genoma a preços acessíveis.