Sobrevivência celular após irradiação
Investigação do crescimento e morte celular induzida por radiação, definido como o período de tempo necessário para uma completa perda da capacidade de proliferação ou exaltação da capacidade de proliferação, é um dos métodos mais comum e confiável para estudar os efeitos da radiação nas células. Para as experiências de irradiação, nosso laboratório verificou que as leituras de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foram proporcionais ao número de células in vitro, pelo menos na fase de crescimento exponencial (dados não mostrados). 12C6+ irradiação iônica com alta energia geralmente resulta na morte da grande maioria das células. A fração da morte celular na fase de retardo após a irradiação e as mudanças no tempo de duplicação podem ser medidas através de ensaios em vários pontos de tempo após a irradiação. Como o nosso ensaio não foi apenas uma determinação de um único ponto de sobrevivência, as informações sobre o desempenho de crescimento também podem ser adquiridas facilmente. A curva de sobrevivência foi desenhada numa escala logarítmica natural da fração de sobrevivência versus diferentes parâmetros físicos.
C. tyrobutyricum 25755 células foram irradiadas 20 h após a semeadura. As cepas com menor atividade metabólica e a proliferação mais lenta ou células que deixaram de proliferar foram excluídas do ensaio por lavagem e tripsinização quando o revestimento foi feito após a irradiação. A fração de sobrevivência obtida da Equação (1) foi comparada com um conjunto representativo de dados experimentais. A Figura 1 mostra uma comparação das curvas de sobrevivência após a irradiação de 12C6+-ion a diferentes energias de feixe para as várias estirpes de C. tyrobutyricum ATCC 25755. Os resultados do ensaio MTT são traçados contra a dose de irradiação (10 a 50 Gy) a 68 AMeV de energia e 106 a 108 iões – níveis pulse-1, que foram e0 → e-4.5 para a Figura 1A, e0 → e-5.8 para a Figura 1B e e0 → 0 para a Figura 1C. A Figura 1D-F mostra os dados de sobrevivência celular a partir dos resultados do ensaio MTT contra a dose de irradiação (10 a 50 Gy) a 114 AMeV de energia e 106 a 108 de íons-pulse-1, que foram e0 → 0. Em geral, foi obtida concordância suficiente entre os cálculos e os dados experimentais. Para as cepas tratadas a 68 AMeV, a equação subestimou a eficácia da dose, enquanto que para as células irradiadas a altas energias (114 AMeV), o resultado foi superestimado. O desvio máximo, derivado da razão entre as doses calculadas e medidas para um determinado nível de efeito, foi de 15%. A fração de sobrevivência das cepas dependeu fortemente das características físicas particulares do feixe de 12C6+-ion, conforme determinado pela energia, dose e íons – pulso-1 das partículas em consideração (Figura 1). Obviamente, a fração de sobrevivência diminuiu com o aumento da energia dos íons de carbono. Como esperado, o logaritmo de sobrevivência dos ensaios mostrou as mesmas características: a sobrevivência dependeu da energia, iões-pulse-1 e dose de irradiação de 12C6+-iões. O aumento de um parâmetro físico de cada vez levou a uma diminuição da taxa de sobrevivência. Sobrevida muito limitada (e-3,5 → e-6,5) foi obtida quando o 12C6+-ion foi irradiado usando 114 AMeV de energia, dose de 20 a 40 Gy e 106 a 108 ions-pulse-1.
O efeito da irradiação de 12C6+-ion na sobrevivência do Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755. As células foram irradiadas 20 h após a semeadura e a extensão da sobrevivência foi determinada pelo ensaio de MTT. Os dados de sobrevivência são traçados em relação aos níveis de irradiação. (A-C) 12C6+-ion foram acelerados até 68 AMeV, e seus íons/pulsos variaram de 106 a 108, a uma taxa de dose de 10 a 50 Gy. (D-F) 12C6+-iões foram acelerados até 114 AMeV, e seus íons/pulso variaram de 106 a 108, a uma taxa de dose de 10 a 50 Gy. Células com baixa atividade metabólica e lenta proliferação ou células que deixam de proliferar foram excluídas do ensaio por lavagem e tripsinização quando o revestimento foi feito após a irradiação.
Muitos tipos de células são caracterizados por divisão celular regular a cada 12 a 24 h. Devido ao poder de crescimento exponencial, uma única célula pode produzir milhares de células filhas dentro de aproximadamente 9 a 12 ciclos normais de divisão, ou seja, alguns dias. Após a irradiação, os sobreviventes podem então ser compostos por alguns mutantes. Uma porcentagem muito pequena dos sobreviventes do C. tyrobutyricum ATCC 25755 pode mostrar uma capacidade melhorada de produzir butirato.
Os efeitos do ácido butírico no crescimento celular após a irradiação
C. tyrobutyricum ATCC 25755 usa glicose ou xilose como uma fonte de carbono e energia. O monossacarídeo é transportado para a célula através de um sistema de absorção de fosfo-enolpiruvado-dependente da fosfo-transferase. Posteriormente, a glicose ou xilose é metabolizada via glicólise , que exibe uma dependência insignificante do pH na faixa de pH 7 a pH 5,5. Entretanto, as fermentações foram interrompidas quando a glicose ou xilose não foi mais consumida pelas células por causa da inibição pelo butirato. Para investigar melhor o efeito específico da irradiação nos perfis de crescimento celular (com base nas medições da densidade óptica (DO) da suspensão celular a 600 nm), foram realizadas culturas individuais em lotes P2-médio quimicamente definidos (realizadas em frascos de soro) contendo 42 g-L-1 de glicose e suplementados com 3,6, 7,2 e 10,8 g-L-1 de ácido butírico. O pH da cultura de C. tyrobutyricum ATCC 25755 (Figura 2A, controle) caiu para cerca de 4,8 (ΔpH de 1,4, de pH 6,2) comparado com quando foi suplementado com 3,6 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A1), 7.2 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A2) e 10,8 g-L-1 de ácido butírico (Figura 2A3), os valores de pH correspondentes foram de cerca de 6,0 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,5), 6,1 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,4) e 5,9 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,4), respectivamente. Entretanto, quando a cultura foi irradiada com 68 AMeV a uma dose de 40 Gy (Figura 2D, controle), o pH caiu para cerca de 4,8 (ΔpH de 1,7 a partir de 6,5) enquanto que a uma dose de 40 Gy (suplementado com 3,6 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D1), uma dose de 40 Gy (suplementado com 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D2) e uma dose de 40 Gy (suplementado com 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D3), os valores de pH foram cerca de 4,6 (ΔpH de 1,6 a partir de 6,2), 4,8 (ΔpH de 1,4 a partir de 6,2) e 5,9 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,2), respectivamente. Quando a cultura foi irradiada a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy (Figura 2G, controle), o pH caiu para cerca de 5,7 (ΔpH de 0,6 a partir de 6,3), enquanto que a uma dose de 40 Gy (suplementada com 3,6 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G1), uma dose de 40 Gy (suplementada com 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G2) e uma dose de 40 Gy (suplementado com 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G3), os valores de pH foram cerca de 5,7 (ΔpH de 0,6 a partir de 6,3), 5,4 (ΔpH de 0,9 a partir de 6,3) e 5,6 (ΔpH de 0,7 a partir de 6,3), respectivamente. Quando a cultura foi irradiada a 68 AMeV e uma dose de 20 Gy (suplementada com 7,2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2B2), o pH caiu para cerca de 4,4 (ΔpH de 0,9 a partir de 6,3) enquanto que a uma dose de 30 Gy (suplementada com 7.2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2C2) e uma dose de 40 Gy (suplementado com 7,2 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2D2), os valores de pH foram cerca de 4,6 (ΔpH de 1,7 a partir de 6,3) e 4,8 (ΔpH de 1,5 a partir de 6,3), respectivamente. Quando a cultura foi irradiada a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy (suplementada com 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2E3), o pH diminuiu para 5,9 (ΔpH de 0,4 a partir de 6,3), enquanto que a uma dose de 30 Gy (suplementada com 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2F3) e uma dose de 40 Gy (suplementada com 10,8 g-L-1 de ácido butírico) (Figura 2G3), os valores de pH foram cerca de 6.0 (ΔpH de 0,3 a partir de 6,3) e 5,8 (ΔpH de 0,5 a partir de 6,3), respectivamente.
Curso temporal das atividades das células do tipo selvagem e irradiadas em função das concentrações adicionadas de ácido butírico durante as primeiras 54 h de fermentação. (A) Crescimento celular das cepas do tipo selvagem, não afetado pela adição de butirato (culturas de controle). (B-D) Crescimento celular das cepas irradiadas (energia 68 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy), não afetado pela adição de butirato (culturas de controle). (E,F) Crescimento celular das estirpes irradiadas (energia 114 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy), não afetado pela adição de butirato (culturas controle). ( A1-A3) Os efeitos da adição de butirato no crescimento celular do tipo selvagem. As culturas em lotes individuais foram realizadas em P2-médio quimicamente definido (realizado em frascos de soro) contendo glicose (aproximadamente 42 g-L-1) e suplementado com 3,6 (A1), 7,2 (A2) e 10,8 g-L-1 (A3) de ácido butírico. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) O efeito da adição de butirato no crescimento das células irradiadas (energia 114 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy). As culturas batch individuais foram realizadas em P2-médio quimicamente definido (realizadas em frascos de soro) contendo glicose (aproximadamente 42 g-L-1) e suplementadas com 3,6 (X1), 7,2 (X2) e 10,8 g-L-1 (X3) de ácido butírico. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Os efeitos da adição de butirato no crescimento das células irradiadas (energia 114 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy). As culturas batch individuais foram realizadas em P2-médio quimicamente definido (realizadas em frascos de soro) contendo glicose (aproximadamente 42 g-L-1) e suplementadas com 3,6 (X1), 7,2 (X2) e 10,8 g-L-1 (X3) de ácido butírico.
Estas diferenças de pH regulam o interruptor temporal associado à formação de solvente para cada estirpe irradiada. Isto sugere que as cepas do tipo selvagem e irradiadas exibiram um padrão metabólico bifásico fortemente influenciado pelo pH do meio. Como tendência geral, as células inicialmente consumiram glicose para suportar o crescimento e produzir e excretar ácidos orgânicos (butirato e acetato) como metabólitos primários (acidogênese), o que causou uma diminuição do pH médio quando se acumularam a certos níveis. Este aumento da acidez do caldo deslocou a formação de ácidos para a produção de solventes quando a cultura atingiu a fase estacionária de crescimento celular (solventogénese). Em pH alto, os ácidos orgânicos são formados principalmente, enquanto que em pH baixo, a produção de solventes é estimulada. Como esperado, a natureza do desvio metabólico e o padrão cinético da formação do solvente foram dependentes da cepa, uma vez que as cepas irradiadas exibiram características genéticas e metabólicas intrínsecas. O ácido butírico já foi relatado anteriormente para inibir o crescimento celular. Os resultados mostraram que nas cepas do tipo selvagem, houve uma inibição gradual do crescimento celular, sem nenhum crescimento realista observado em concentrações de ácido butírico acima de 3,6 g-L-1. Entretanto, nas cepas irradiadas, não houve inibição gradual do crescimento celular, e nenhum crescimento realista foi observado para concentrações de ácido butírico acima de 10,8 g-L-1,
Para examinar mais detalhadamente o efeito do butirato adicionado, os perfis de crescimento celular (baseados em medidas de DO) para as cepas do tipo selvagem e cepas irradiadas foram comparados (Figura 2A1-G3) durante as primeiras 54 h de fermentação. Curiosamente, a tolerância de ácido butírico das cepas foi muito aumentada quando a energia e a dose de 12C6+-ion de irradiação foi aumentada. As vias metabólicas do metabolismo da glicose em C. tyrobutyricum ATCC 25755 são mostradas na Figura 3. A acetil-CoA, acetoacetil-CoA e butiril-CoA são três intermediários chave, e são de particular interesse para a fermentação com respeito ao potencial de formação de diferentes produtos durante a acidogênese ou solventogênese. Estes intermediários são importantes pontos de ramificação que direcionam o fluxo metabólico tanto para a formação de ácido quanto para a formação de solventes. Como último intermediário chave, o butiril-CoA inicia a formação de ácido butírico/brutirato. O butirato é produzido pelas actividades sequenciais do PTB, e do BK . Ambas as enzimas são mais ativas durante a acidogênese e suas atividades específicas diminuem durante a solventogênese, duas vezes para o PTB e seis vezes para o Buk . Normalmente é necessária uma forte atividade dependente do pH com um ótimo in vitro a níveis de pH acidogênico de 5,5 (ótimo em torno de pH 4,7) e um pH in vivo (endógeno) superior a 5,5 para induzir a solventogênese. No entanto, uma análise comparativa destas parcelas revelou claramente um grande agrupamento composto pelas estirpes irradiadas a 68 AMeV e 40 Gy e as estirpes irradiadas a 114 AMeV e doses de 30 e 40 Gy. Os dois grupos mostraram uma tolerância geral muito semelhante ao aumento das concentrações de butirato quando comparados com as bactérias do tipo selvagem.
Vias metabólicas do metabolismo da glicose no Clostridium tyrobutyricum . As enzimas são indicadas por letras como se segue: lactato desidrogenase; piruvato-ferredoxina oxidoredutase; NADH-ferredoxina oxidoredutase; NADPH-ferredoxina oxidoredutase; hydrogenase; fosfato acetiltransferase (fosfotransacetilase); acetato quinase; acetaldeído desidrogenase; etanol desidrogenase; tiolase (acetil-CoA acetiltransferase); acetoacetil-CoA; acetato/boritrato:CoA transferase; acetoacetato descarboxilase; 3-hidroxilbutil-CoA desidrogenase; crotonase; butiril-CoA desidrogenase; fosfato butiltransferase (fosfobutirilase); butirato quinase.
Efeito da irradiação de íons 12C6+ na produção de ácido butírico
A produção de ácido butírico das cepas irradiadas foi muito melhorada tanto em termos de concentração do produto final quanto de rendimento em comparação com a cepa do tipo selvagem, como mostrado na Figura 4B,E. A cultura não irradiada (cepa selvagem, controle) C. tyrobutyricum inoculada em meio glicose-minimal começou a consumir açúcar quase imediatamente, com a produção de ácido butírico começando 12 a 18 h mais tarde (Figura 4A,B). A mesma cultura de controle inoculada em meio de crescimento clostridial (CGM) contendo 60 g-L-1 de glicose precisou ser aclimatada durante 96 h, apesar de as cepas irradiadas e fermentações de cepas do tipo selvagem terem sido testadas sob as mesmas condições. O período prolongado de metabolismo e produtividade mínimos é porque a radiação (parâmetros diferentes) causou um atraso na fase de log de crescimento celular (Figura 4C,F). A tolerância ao ácido butírico das cepas irradiadas foi bastante aumentada, permitindo-lhes produzir mais ácido butírico, resultando em completa utilização de glicose e produção de mais de 32 g-L-1 de ácido butírico e níveis similares de biomassa celular. Além disso, a relação ácido butírico/controle aumentou de 1,0 para 1 para a cepa do tipo selvagem.52 para as linhagens irradiadas a 114 AMeV e 40 Gy, 1,37 para as linhagens irradiadas a 114 AMeV e 30 Gy, 1,41 para as linhagens irradiadas a 68 AMeV e 40 Gy, e 1,31 para as linhagens irradiadas a 68 AMeV e 30 Gy. Esta tendência indica que o fluxo de carbono e energia foram redistribuídos nas vias metabólicas das estirpes irradiadas, o que também resultou em mudanças significativas na produção de vários produtos de fermentação. Deve-se notar que a produção de ácido acético (dados não mostrados) se nivelou muito mais cedo do que o butirato/butírico durante a fermentação. As fermentações pararam quando a glicose não foi mais consumida pelas células devido a um acúmulo de ácidos orgânicos e resíduos no caldo, o que causou inibição do crescimento celular e outras atividades. Entretanto, as cepas irradiadas foram mais tolerantes ao ácido butírico, como indicado pela concentração final de butirato muito mais elevada alcançada nas fermentações com estas cepas irradiadas em comparação com as cepas do tipo selvagem. Isto não é totalmente surpreendente; como mostrado na Figura 3, a maior tolerância ao ácido butírico das cepas irradiadas também pode ser atribuída à redução do fluxo através do caminho PTA/AK do butirato. Como as linhagens irradiadas não eram mais dependentes da via PTA/AK para produção de energia e sobrevivência, elas se tornaram menos sensíveis à inibição do ácido butírico.
Comparação da produção de ácido e biomassa em peso seco do tipo selvagem e C. tyrobutyricum irradiado cultivado com glicose (contendo 60 g-L-1) em meio de crescimento clostridial a 37°C a pH 5,5 e 6,0. (A-C) Impacto da irradiação de 12C6+-ion (energia 68 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy) sobre a concentração de glicose, produção de ácido butírico e peso seco da biomassa. (D-F) Impacto da irradiação de 12C6+-ion (energia 114 AMeV e doses de 20, 30 e 40 Gy) na concentração de glicose, na produção de ácido butírico e no peso seco da biomassa. (G) SDS-PAGE de proteínas celulares de C. tyrobutyricum. Pista WT: tipo selvagem; pista 1: células irradiadas a 68 AMeV e uma dose de 30 Gy; pista 2: células irradiadas a 68 AMeV e uma dose de 40 Gy; pista 3: células irradiadas a 114 AMeV e uma dose de 30 Gy; pista 4: tipo selvagem e células irradiadas a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy; pista MW: marcadores de peso molecular de proteínas.
Indução dos genes ack e pta, que codificam as enzimas associadas à via de formação do acetato, melhorando significativamente a produção de ácido butírico. Para melhor compreender a cinética de fermentação do metabolismo da glicose após exposição do C. tyrobutyricum à irradiação de 12C6+-ion e os danos resultantes aos genes ack e pta, foi estudada e comparada a expressão proteica de cepas do tipo selvagem e irradiadas. A Figura 4G mostra os resultados da SDS-PAGE. A análise confirmou a expressão da proteína (peso molecular, aproximadamente 85 kDa) em quatro cepas irradiadas, com o maior nível de expressão protéica na pista 4. A quantidade de uma proteína de aproximadamente 106 kDa foi muito maior para a estirpe irradiada a 114 AMeV e 40 Gy do que a estirpe do tipo selvagem. AK e PTA de vários microorganismos foram caracterizados, mas os resultados mostraram grandes variações em seu peso molecular. Assim, foram realizados ensaios de atividade enzimática para estudar melhor os papéis da AK, PTA e PTB nas vias de formação de ácido (Figura 3). A seletividade metabólica em C. tyrobutyricum é influenciada pelo estágio de crescimento, com culturas de crescimento exponencial produzindo tanto ácidos butíricos quanto acéticos, enquanto taxas de crescimento estacionário mais lento tendem a produzir ácido butírico . Como tal, durante a fase de crescimento logarítmico de cada lote, amostras de cultura foram removidas e analisadas para as atividades de PTA, PTB e AK nas cepas irradiadas e do tipo selvagem. As atividades enzimáticas específicas para PTA, PTB e AK nas cepas irradiadas (parâmetros físicos diferentes) foram testadas e suas atividades relativas foram comparadas com as da cepa do tipo selvagem. A atividade de AK foi reduzida em aproximadamente 47% para as cepas irradiadas a 114 AMeV e 40 Gy, 31% para as cepas irradiadas a 114 AMeV e 30 Gy e 26% para as cepas irradiadas a 68 AMeV e 40 Gy. Em comparação com as cepas do tipo selvagem, as cepas irradiadas a 114 AMeV e 40 Gy tinham uma atividade AK menor (47%), mas atividade PTA inesperadamente maior (129%), embora atividades PTB similares. Como as cepas irradiadas a 114 AMeV tinham uma atividade AK muito menor, a via PTA-AK teria sido prejudicada e, portanto, produziram mais butirato (60 g-L-1) a partir da glicose do que as cepas do tipo selvagem. Como mencionado anteriormente, estes melhoramentos e melhorias podem ser atribuídos a uma maior tolerância à inibição do butirato e, em certa medida, à redução do fluxo de carbono através da via PTA-AK, como evidenciado pelo aumento da razão butirato/acetato nas cepas irradiadas.
Efeito de 12C6+irradiação na produção de ácido e crescimento de C. tyrobutyricum
Uma experiência foi conduzida em modo de fermentação usando glucose como fonte primária de carbono a fim de determinar a capacidade de produção de butirato de C. tyrobutyricum ATCC 25755 após a irradiação. Como pode ser visto na Figura 5A,B, a produção de ácido butírico a partir da glicose aumentou significativamente, de 0,43 g-g-g-1 para as cepas do tipo selvagem para 0,56 g-g-1 para a cepa irradiada a 68 AMeV e uma dose de 30 Gy, 0.59 g-g-g-1 para a cepa irradiada a 68 AMeV e uma dose de 40 Gy, 0,63 g-g-1 para a cepa irradiada a 114 AMeV e uma dose de 30 Gy, e 0,66 g-g-1 para a cepa irradiada a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy. É de notar que o rendimento de butirato para a estirpe irradiada a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy teria sido maior (>0,66 g-g-g-1) se o consumo de glicose durante a fase de defasagem fosse negligenciado. O ácido acético produzido pela estirpe irradiada a 68 AMeV e doses de 30 e 40 Gy foram similares ao do tipo selvagem. Entretanto, o ácido acético produzido pela cepa irradiada a 114 AMeV e as doses de 30 e 40 Gy diminuíram em comparação com o do tipo selvagem. Como mostrado na Figura 5B, a produção de ácido acético a partir da glicose também diminuiu significativamente, de aproximadamente 0,11 g-g-g-1 para a cepa do tipo selvagem para cerca de 0,08 g-g-1 para a cepa irradiada a 114 AMeV e 30 Gy, e cerca de 0,07 g-g-1 para a cepa irradiada a 114 AMeV e 40 Gy. Entretanto, a razão butirato/acetato (g/g) aumentou de 3,99 para a cepa do tipo selvagem para 5,82 para as cepas irradiadas, uma clara indicação de que as vias metabólicas nas cepas irradiadas foram deslocadas para favorecer a produção de ácido butírico em detrimento da produção de ácido acético. Como mostrado na Figura 3, uma vez que as atividades de AK e PTA foram significativamente reduzidas nas cepas irradiadas, mais piruvato deve ter sido catabolizado através da via de produção de butirato, levando a maiores rendimentos de butirato a partir da glicose. Além disso, o ácido butírico também poderia ter promovido uma mudança mais precoce para a via de produção de ácido, o que poderia se refletir em uma taxa de crescimento mais lenta. Pela mesma razão, as amostras irradiadas sofreram uma taxa de crescimento mais lenta porque menos ATP foi produzido a partir da via produtora de acetato (PTA-AK), que normalmente pode gerar mais ATP por mole de glicose metabolizada do que a via produtora de butirato (PTB-BK).
Comparação da produção de ácido para as células de C. tyrobutyricum do tipo selvagem e irradiadas. (A) A produção de ácido butírico e ácido acético foi estimada a partir das inclinações das parcelas lineares para as células do tipo selvagem e as células irradiadas a 68 AMeV e doses de 30 e 40 Gy. (B) A produção de ácido butírico e ácido acético foi estimada a partir das inclinações das parcelas lineares para as células do tipo selvagem e as células irradiadas a 114 AMeV e doses de 30 e 40 Gy. (C) Linearização (integração) dos perfis cinéticos de crescimento do peso seco da biomassa ao longo do tempo, utilizando uma transformação natural do logaritmo. As taxas máximas de crescimento específico para o tipo selvagem e as células irradiadas foram calculadas de acordo com o exemplo dado para as células irradiadas a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy cultivadas em meio de crescimento Clostridium contendo 60 g-L-1 de glicose. BDW, peso seco da biomassa.
Um gráfico de μ max foi então determinado em altas concentrações de glicose inicial (40, 60, 80 e 120 g-L-1) ajustando os dados de fermentação às previsões da simulação do modelo. Linearização (integração) dos perfis cinéticos de crescimento do peso seco da biomassa (BDW) ao longo do tempo foram obtidos usando a transformação natural do logaritmo:
Onde x(t) = concentração de BDW em cada vez x 0; t = concentração inicial de BDW; μ max = taxa máxima de crescimento específico (h-1); e a taxa de crescimento específico é μ = (1/x(t)) – (dx/dt). Para simplificar, foi assumido que todas as bactérias seguiram a lei exponencial do crescimento celular em uma cultura em lote, de acordo com um modelo cinético de primeira ordem. A taxa de crescimento específico das células, ou aumento da massa celular ao longo do tempo, representa uma mudança na seletividade com diferentes taxas de crescimento, o que tem um impacto significativo no processo de fermentação . O crescimento rápido das células tem uma maior demanda de energia e, de preferência, produz ácido acético. Em baixas taxas de crescimento, a produção de ácido butírico é favorecida em relação ao ácido acético . Para a fermentação contínua, a produção de butirato/ácido butírico é maior quando μ é menor. Quando o μ tende a zero, ocorre uma oscilação na produtividade . Estas equações permitem uma comparação da taxa de crescimento dos sistemas batch e contínuo dentro do tipo selvagem e das cepas irradiadas.
O modelo não é independente de meios: os meios utilizados como descrito acima afetam tanto a taxa de crescimento celular quanto as quantidades de butirato/ácido butírico produzidas, e diferentes perfis de consumo de glicose produziriam resultados diferentes. Para melhor quantificar a concentração ótima de glicose para o crescimento celular, as taxas máximas de crescimento específico foram determinadas para as cepas do tipo selvagem e irradiadas a partir de dados cinéticos retirados da fase de crescimento exponencial e plotados contra a concentração de glicose adicionada. Como pode ser visto na Figura 5C, as taxas máximas de crescimento específico para as cepas irradiadas a 114 AMeV e uma dose de 40 Gy foram calculadas de acordo com o exemplo onde a cepa foi cultivada em meio CGM contendo 60 g-L-1 de glicose. Foi escolhida a melhor faixa linear de pontos de dados que correspondia à fase de crescimento exponencial da estirpe. Em alguns casos, onde a exigência mínima de três pontos de dados experimentais não foi satisfeita, foi utilizada uma expressão alternativa que representava apenas dois pontos extremos (no início e no final da fase exponencial). A inclinação em linha reta (m = μmax) dá a taxa máxima de crescimento específico (0,213 h-1). O modelo de regressão linear unária (y = 0,2129x – 2,6457) teve um coeficiente de determinação ajustado de R2 = 0,9765, indicando que todos os pontos de dados foram incluídos na linha de melhor ajuste e nenhum ponto de dados variou a partir desta linha. Além disso, cada taxa de crescimento específica foi estimada a partir da inclinação do gráfico semi-logarítmico correspondente do BDW versus o tempo. As barras de erro são expressas em termos do desvio padrão (DP) obtido a partir dos cálculos de cada réplica de fermentação independente para as cepas irradiadas e tipo selvagem (os dados originais não são mostrados). Os resultados demonstram que estas cepas irradiadas tiveram uma taxa de crescimento específico significativamente menor (μ = 0,38 ±0,03 a 0,21 ±0,02 h-1) em comparação com o tipo selvagem (μ = 0,38 a 0,42 h-1). O uso de 12C6+-ion irradiação a 68 AMeV, 20 a 40 Gy e 106 a 108 ions-pulse-1 resultou em fases de defasagem particularmente longas de 10, 12 e 16 h, respectivamente. Em comparação, o uso da irradiação de 12C6+-ion a 114 AMeV, 20 a 40 Gy e 106 a 108 ions-pulse-1 resultou em fases de retardo de 12, 18 e 24 h, respectivamente. Estas fases de maior retardamento podem ser parcialmente atribuídas aos diferentes parâmetros de radiação e à baixa densidade de inoculação utilizada na fermentação. A menor taxa específica de crescimento das células irradiadas pode ser resultado da carga metabólica colocada nas células como resultado da menor quantidade de energia gerada pelo metabolismo da glicose devido aos danos induzidos com maior energia e doses. Em comparação com as linhagens do tipo selvagem, as linhagens de 20 e 30 Gy irradiadas a 68 AMeV tinham perfis de crescimento e consumo de glicose semelhantes, com uma taxa de crescimento específico quase idêntica de μ = 0,42 ±0.03 h-1, enquanto as cepas de 30 e 40 Gy irradiadas a 114 AMeV apresentaram uma fase de defasagem significativamente mais longa, menor consumo de glicose e uma taxa de crescimento específico muito menor de μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) e μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Como observado anteriormente, o acetato é sintetizado através de reações PTA e AK com esta última reação fornecendo ATP (Figura 3). Para a biossíntese do butirato, duas moléculas de acetil-CoA são condensadas em acetoacetílico-CoA, seguido por uma redução para butiril-CoA, que é então convertido em butirato via reações PTB e BK com geração de ATP. A menor taxa de crescimento específico para as cepas irradiadas (energia 114 AMeV e doses de 30 e 40 Gy) pode ser atribuída à carga metabólica nas células causada pela geração de menos energia (ATP) durante o metabolismo da glicose, devido aos danos causados pela irradiação de ack e pta. O BDW da glicose para as linhagens irradiadas também variou das linhagens do tipo selvagem. O gráfico de BDW versus tempo e taxa de crescimento específica das cepas irradiadas indicou que o carbono e o fluxo energético foram redistribuídos ao longo das vias metabólicas dessas cepas, o que também resultou em mudanças significativas na produção ácida de produtos de fermentação.