- Abstract
- 1 Introdução
- 2 Materiais e métodos
- 2.1 Crescimento do H. marismortui sobre glicose, acetato, misturas glicose/acetato e sobre peptídeos
- 2.2 Preparação de extratos celulares
- 2.3 Determinação das atividades enzimáticas
- 3 Resultados
- 3.1 Crescimento de células adaptadas ao acetato sobre glicose
- 3.2 Crescimento de células adaptadas ao glucose-adaptadas em acetato
- 3.3 Crescimento em misturas glicose/acetato
- 3.4 Células adaptadas à glicose em peptídeos
- 4 Discussão
- 4.1 A formação de acetato em H. marismortui é catalisada pelo ACD como parte do metabolismo de “overflow”
- 4.2 A ativação do acetato para acetil-CoA no H. marismortui é catalisada pelo ACS
- 4.3 Repressão catabolita específica da glicose em H. marismortui
- Author notes
Abstract
Haloarcula marismortui formou acetato durante o crescimento aeróbio em glucose e utilizou o acetato como substrato de crescimento. Nas misturas glicose/acetato foi observado crescimento diauxico com glicose como o substrato preferido. A regulação das atividades enzimáticas, relacionadas à glicose e ao metabolismo do acetato, foi analisada. Verificou-se que tanto a glicose desidrogenase (GDH) quanto a acetil-CoA sintetase (ADP) formadoras de acetil-CoA sintetase (ACD) foram upreguladas durante períodos de consumo de glicose e formação de acetato, enquanto que tanto a acetil-CoA sintetase (ACS) formadoras de AMP quanto a malato-sintase (EM) foram desreguladas. Por outro lado, a upregulação de ACS e EM e a desregulação de ACD e GDH foram observadas durante os períodos de consumo de acetato. A EM também foi upregulada durante o crescimento em peptídeos na ausência de acetato. A partir dos dados, concluímos que um ACD glicosilinduzível catalisa a formação de acetato, enquanto que a ativação do acetato é catalisada por uma SCA induzível por acetato; tanto a SCA como a EM são aparentemente induzidas pelo acetato e reprimidas pela glicose.
1 Introdução
Várias artérias halofílicas, incluindo Haloarcula marismortui, crescem sobre a glicose, que é degradada através de uma via Entner-Doudoroff (ED) modificada e semifosfórica. Foi demonstrado que durante o crescimento exponencial sobre a glicose foram formadas quantidades significativas de acetato . Estudos recentes indicam que a formação de acetato a partir da acetil-CoA na arcada halofílica é catalisada por uma acetil-CoA sintetase formadora de ADP (ACD) (acetil-CoA + ADP + Pi⇆ acetato + ATP + CoA). Esta sintetase incomum foi encontrada em todas as artérias formadoras de acetato, incluindo hipertermófilos anaeróbios, e representa um novo mecanismo em procariotas de formação de acetato e síntese de ATP. Na arca hipertermófila anaeróbia, por exemplo, Pyrococcus furiosus, o ACD representa a maior reação de conservação de energia durante o metabolismo do açúcar, piruvato e peptídeo. Em contraste com o mecanismo de uma enzima do arquebactéria, todas as bactérias usam o mecanismo “clássico” de duas enzimas para a conversão de acetil-CoA em acetato, envolvendo acetiltransferase fosfato (PTA) e acetato quinase (AK) .
Haloarchaea several, incluindo H. marismortui, Haloferax vulcanii e Halorubrum saccharovorum têm sido relatados para crescer em acetato como substrato. O metabolismo do acetato é iniciado pela sua ativação à acetil-CoA. Recentemente, fornecemos as primeiras evidências de que a ativação do acetato à acetil-CoA na haloarquéia é catalisada por uma acetil-CoA sintetase (ACS) formadora de AMP (acetato + ATP + CoA → acetil-CoA + AMP + PPi) . ACS é a principal enzima de ativação do acetato para a maioria dos organismos que utilizam acetatos dos três domínios da vida . Apenas algumas bactérias, por exemplo, Corynebacterium glutamicum, e também o Arqueão metanogênico acetoclástico Methanosarcina ssp. ativam acetato para acetil-CoA através do casal AK/PTA . Assim, a via AK/PTA pode operar reversivelmente in vivo, ou seja, tanto na direção da formação do acetato como também na direção da ativação do acetato. Em contraste, as primeiras análises sugerem que na haloarquéia ACD, a contraparte arqueal do casal AK/PTA, opera in vivo na direção da formação do acetato, embora a enzima catalise uma reação reversível in vitro.
Para elucidar ainda mais o papel fisiológico e para obter os primeiros conhecimentos sobre a regulação dependente do substrato das enzimas conversoras de acetato e acetil-CoA na haloarqueia, realizamos experimentos de deslocamento do substrato com H. marismortui, e analisamos o crescimento em glicose, acetato, misturas glicose/acetato e peptídeos. Durante os perfis de atividade de crescimento das enzimas conversoras de acetato e acetil-CoA, ACD e ACS, bem como da glicose desidrogenase, a primeira enzima na degradação da glicose através da via modificada de ED, foram analisados. Além disso, foram determinadas as atividades da malato-sintase, uma enzima chave do ciclo do glioxilato, proposta para ser operante na haloarquéia.
2 Materiais e métodos
2.1 Crescimento do H. marismortui sobre glicose, acetato, misturas glicose/acetato e sobre peptídeos
Haloarcula marismortui foi cultivado aerobicamente a 37 °C em um meio complexo contendo extrato de levedura, casaminoácidos e adicionalmente glicose e/ou acetato, como descrito anteriormente . Para o crescimento em mistura glicose/acetato este meio foi suplementado com 12,5 mM de glicose e 30 mM de acetato. O crescimento em peptídeos foi realizado no meio complexo, na ausência de acetato e glicose. Foram realizadas experiências de crescimento em 2 l de fermentadores (fairmen tec, Alemanha) com uma velocidade de agitação de 500 rpm e uma produção de ar comprimido de 600 ml por minuto. O crescimento foi seguido pela medição da densidade óptica a 578 nm (ΔOD578). ΔOD578 de 1 correspondeu a um conteúdo proteico de 0,5-0,6 mg/ml. Glicose e acetato foram determinados enzimaticamente como descrito em .
2.2 Preparação de extratos celulares
Em várias fases de crescimento foram colhidas células de H. marismortui (100-200 ml da cultura) e os extratos celulares foram preparados como descrito em . A proteína foi determinada pelo método de Bradford usando albumina de soro bovino como padrão.
2.3 Determinação das atividades enzimáticas
Todos os ensaios enzimáticos foram realizados sob condições aeróbicas a 37 °C em cuvetes cheias com 1 ml de mistura de ensaio. As enzimas auxiliares foram geralmente adicionadas pouco antes do início da reação e foi assegurado que essas enzimas não estavam limitando a taxa. Uma unidade (1 U) de atividade enzimática é definida como 1 μmol substrato consumido ou produto formado por minuto.
Acetyl-CoA synthetase (ADP-forming) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) foi medida como descrito em .
Acetyl-CoA synthetase (AMP-forming) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) foi monitorada como liberação de HSCoA dependente de PPi e AMP de acordo com Srere et al. com o reagente de thiol de Ellman, 5′5-dithiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), medindo a formação do ânion tiofenolato a 412 nm (ε412= 13.6 mM-1 cm-1). A mistura do ensaio continha 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1 mM acetil-CoA, 2 mM AMP, 2 mM PPi e extrato.
Malate synthase (E.C. 4.1.3.2.) foi monitorada em um ensaio modificado de acordo com Serrano et al. com DTNB. A mistura do ensaio continha 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM acetil-CoA, 0,5 mM glioxilato e extrato.
Glucose desidrogenase (E.C. 1.1.1.47) foi medida de acordo com Johnsen et al. .
Acetate kinase (E.C. 2.7.2.1.) foi medida conforme descrito em .
Phosphotransacetylase (E.C. 2.3.1.8.) foi monitorada como a liberação de HSCoA dependente de Pi da acetil-CoA com DTNB . A mistura do ensaio continha 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM acetil-CoA, 5 mM KH2PO4 e extrato.
3 Resultados
Para investigar a função fisiológica e a regulação das enzimas relacionadas ao acetato e ao metabolismo da acetil-CoA, células de H. As células de H. marismortui pré-crias em diferentes substratos foram deslocadas para o meio contendo acetato e/ou glicose e peptídeos, respectivamente, e os perfis de atividade de ACD, ACS, GDH e MS foram analisados.
3.1 Crescimento de células adaptadas ao acetato sobre glicose
Após uma fase de retardo, as células cresceram exponencialmente e a glicose foi completamente consumida. Paralelamente ao consumo de glicose, quantidades significativas de acetato foram formadas. Nesse período as atividades tanto do GDH quanto do ACD aumentaram, enquanto as atividades das SCA e da EM, que eram ativas em células adaptadas ao acetato, foram completamente desreguladas. Na fase estacionária, o acetato excretado foi completamente reconstituído e as atividades de SCA e EM aumentaram, enquanto as atividades de GDH e ACD diminuíram (Fig. 1).
Crescimento de H. marismortui na glicose. Células adaptadas ao acetato foram utilizadas como inóculo. ΔOD578 (quadrados preenchidos), concentração de glicose (triângulos preenchidos), concentração de acetato (círculos preenchidos); atividades enzimáticas: ACD (diamantes preenchidos), GDH (triângulos preenchidos invertidos), ACS (círculos abertos), MS (triângulos abertos).
Crescimento de H. marismortui sobre glicose. As células adaptadas ao acetato foram usadas como inóculo. ΔOD578 (quadrados preenchidos), concentração de glicose (triângulos preenchidos), concentração de acetato (círculos preenchidos); atividades enzimáticas: ACD (diamantes preenchidos), GDH (triângulos preenchidos invertidos), ACS (círculos abertos), MS (triângulos abertos).
3.2 Crescimento de células adaptadas ao glucose-adaptadas em acetato
Células adaptadas ao glucose-adaptadas cresceram em acetato contendo meio inicialmente (cerca de 30 h) com um tempo de duplicação de 10 h até uma densidade óptica (ΔOD578) de 1. Nesta fase de crescimento não foi observado consumo de acetato e as células cresceram em peptídeos presentes no meio. Após este período, as células cresceram com uma taxa de crescimento reduzida até ΔOD578 de 1,8 e o acetato foi completamente consumido. Durante o consumo de acetato as atividades de ACD e GDH diminuíram, enquanto que as atividades de ACS e EM, que não puderam ser detectadas nas células adaptadas ao glucosato, aumentaram. O aumento da atividade da EM começou durante o crescimento nos peptídeos, enquanto que o aumento da atividade da SCA foi paralelo ao consumo de acetato (Fig. 2).
Crescimento de H. marismortui no acetato. Células adaptadas à glucose-adaptadas foram utilizadas como inóculo. Os mesmos símbolos foram usados como descritos na legenda da Fig. 1.
Crescimento de H. marismortui sobre acetato. Células adaptadas à glucose-adaptadas foram usadas como inóculo. Os mesmos símbolos foram usados como descritos na legenda da Fig. 1.
3.3 Crescimento em misturas glicose/acetato
Células de H. marismortui adaptadas ao extrato de levedura e casaminoácidos foram transferidos para o meio contendo tanto glicose quanto acetato. As células mostraram crescimento diauxico com utilização sequencial de primeira glicose e segundo acetato. Na primeira fase de crescimento, as células cresceram até ΔOD578 de 4,0 e a glicose foi consumida. Após o consumo de glicose e uma curta fase de defasagem, as células entraram na segunda fase de crescimento, na qual o acetato foi metabolizado e as células cresceram até um final ΔOD578 de 5,2. Na primeira fase de crescimento, paralelamente ao consumo de glicose, as atividades de ACD e GDH aumentaram, enquanto que a atividade de ACS não pôde ser detectada e a atividade de EM foi completamente desregulada. Na segunda fase de crescimento paralelo à utilização de acetato, as atividades de ACS e EM aumentaram e as atividades de ACD e GDH diminuíram (Fig. 3).
Crescimento de H. marismortui na mistura glicose/acetato. Células adaptadas a constituintes complexos na ausência de glicose e acetato foram utilizadas como inóculo. Os mesmos símbolos foram usados como descritos na legenda da Fig. 1.
Crescimento de H. marismortui sobre mistura de glicose/acetato. Células adaptadas a constituintes complexos na ausência de glicose e acetato foram utilizadas como inóculo. Os mesmos símbolos foram utilizados como descritos na legenda da Fig. 1.
3.4 Células adaptadas à glicose em peptídeos
Células adaptadas à glicose foram deslocadas para o meio contendo 0,25% de extrato de levedura e 0,5% de casaminoácidos na ausência de glicose e acetato. As células cresceram com tempo de duplicação de 13 h até ΔOD578 de 2,5. A formação de acetato não pôde ser detectada. Durante o crescimento exponencial o ACD (de 60 a 20 mU/mg) e o GDH (de 80 a 40 mU/mg) diminuiu, e a actividade da EM, que inicialmente não pôde ser detectada, aumentou até 20 mU/mg. A atividade de ACS não pôde ser detectada durante a fase de crescimento exponencial, mas aumentou durante a fase estacionária (13 mU/mg).
4 Discussão
Neste trabalho analisamos o papel fisiológico das enzimas conversoras de acetato e acetil-CoA (ACD, ACS) em H. marismortui e damos as primeiras evidências para a regulação específica do substrato destas enzimas, bem como para GDH e EM. Os dados são discutidos em comparação com sistemas bacterianos conhecidos.
4.1 A formação de acetato em H. marismortui é catalisada pelo ACD como parte do metabolismo de “overflow”
Crescimento durante o crescimento da glicose e das misturas glicose/acetato, tanto a atividade do ACD como a do GDH aumentaram paralelamente às fases de consumo de glicose e formação de acetato (Figs. 1 e 3). Por outro lado, ambas as atividades diminuíram durante o crescimento em acetato ou peptídeos. Estes dados e a ausência de AK/PTA indicam que a formação de acetato na Haloárcula é catalisada pelo DCA. O papel fisiológico da formação de acetato em H. marismortui e sua regulação durante o crescimento aeróbio sobre a glicose não é compreendido; a formação de acetato pode ser parte de um metabolismo de “transbordamento”, que tem sido estudado com algum detalhe em várias bactérias, por exemplo, Escherichia coli e Bacillus subtilis. Como em H. marismortui, ambas as bactérias excretam acetato durante o crescimento aeróbio sobre o excesso de glicose e o reutilizam na fase estacionária. Tem-se especulado que a excreção de acetato ocorre em condições em que a taxa de glicólise excede a das vias subsequentes, por exemplo, o ciclo do ácido cítrico e a respiração necessária para a completa oxidação da glicose . Sob estas condições, a acetil-CoA é convertida em acetato e excretada. De acordo com esta visão, análises transcripcionais com E. coli e B. subtilis indicam indução glucosa específica de genes glicolíticos e repressão de genes do ciclo do ácido cítrico e da respiração . Uma regulação transcripcional glicose-específica semelhante, ou seja, upregulação de genes glicolíticos da via Entner-Doudoroff modificada, e desregulação de alguns genes do ciclo do ácido cítrico e da respiração tem sido relatada recentemente para o arquebactéria halofílica H. vulcanii. Assim, na haloarchaea, é provável que o metabolismo do excesso de glucose-específico resulte na formação de acetato. A formação de acetato em E. coli e B. subtilis envolve o mecanismo bacteriano de duas enzimas via PTA e AK, enquanto que na Haloarcula a formação de acetato é catalisada pelo ACD, o mecanismo de uma enzima do arquebactéria. Em ambos, E. coli e B. subtilis, foi encontrada glicose para induzir a codificação dos genes pta e ack indicando a regulação coordenada da glicólise e formação de acetato . Até agora, a regulação transcripcional do ACD formador de acetato no arquebactéria H. marismortui ainda não foi analisada. Entretanto, a regulação coordenada do GDH e da atividade do ACD sugere uma regulação transcripcional semelhante do glicose-específico tanto da glicólise pela via Entner-Doudoroff modificada quanto da formação de acetato pelo ACD.
Durante o crescimento aeróbio nos peptídeos H. marismortui não formou acetato e a atividade do ACD foi desregulada. A este respeito, a Haloarcula difere da bactéria E. coli, que forma quantidades significativas de acetato durante o crescimento aeróbio sobre peptídeos no decurso de um metabolismo de “transbordamento” . H. marismortui também difere do arquebactéria anaeróbio hipertermófila P. furioso e outras artérias anaerófilas hipertermofílicas, que formam altas quantidades de acetato por meio de ACD durante o crescimento anaeróbio tanto em açúcares quanto em peptídeos. Durante a fermentação anaeróbia do peptídeo anaeróbio e do açúcar de P. furiosus, a formação de acetato pelo DCA representa o principal local de formação de ATP através da fosforilação do substrato; em contraste, durante a degradação aeróbia de açúcares e peptídeos por H. marismortui a maior parte da energia é conservada pela fosforilação do transporte de elétrons na cadeia respiratória e, portanto, a formação de acetato pelo DCA é menos importante ou dispensável. Assim, a formação de acetato pelo ACD no Haloarcula parece estar restrita ao metabolismo do açúcar no curso de um metabolismo de “transbordamento”.
4.2 A ativação do acetato para acetil-CoA no H. marismortui é catalisada pelo ACS
Isto foi concluído a partir da upregulação da atividade do ACS paralelamente ao consumo de acetato (Figs. 1, 2, 3). Um papel do DCA na ativação do acetato poderia ser descartado, uma vez que o DCA foi desregulado durante os períodos de consumo de acetato. Assim, o TCA na Haloarcula está operando in vivo apenas na direção da formação do acetato. O ACS também é o mecanismo mais comum de ativação do acetato em bactérias onde ele é estritamente regulado; por exemplo, em E. coli e B. subtilis, o gene acs é induzido pelo acetato e reprimido pela glicose . Na Haloarcula, a upregulação da atividade ACS pelo acetato e a desregulação pela glicose sugerem uma regulação semelhante no nível transcripcional, como relatado para as bactérias. Deve-se notar que, em contraste com E. coli e B. subtilis, a bactéria C. glutamicum activa o acetato por uma via AK/PTA induzida por acetato .
Actividade da EM, uma enzima chave do ciclo do glioxilato, foi upregulada durante períodos de consumo de acetato em H. marismortui juntamente com ACS sugerindo regulação de coordenadas específicas do acetato de ACS e o ciclo do glioxilato anaplerótico. Tanto a actividade da EM como a da SCA foram reguladas pela glicose. A indução coordenada específica de acetato de genes das enzimas de ativação do acetato (ver acima) e da via do glioxilato foi relatada para várias bactérias, incluindo E. coli e C. glutamicum. Recentemente, a primeira evidência de indução dos genes de malato sintase e isocitrato lisase pelo acetato foi dada para o arqueão halofílico H. vulcanii.
No entanto, a atividade da EM ao invés da atividade da SCA também foi upregulada durante o crescimento exponencial dos peptídeos na ausência de acetato, indicando que a regulação da EM é mais complexa e não restrita ao acetato. Um papel da EM (e do ciclo do glioxilato) no metabolismo dos peptídeos pode ser explicado pelo fato de que muitos aminoácidos são degradados a acetil-CoA, o que exigiria uma via funcional do glioxilato para o anabolismo. O aumento da atividade da SCA, observado na fase estacionária durante o crescimento dos peptídeos, não pode ser explicado até agora, pode ser devido a uma resposta geral de estresse das células em fase estacionária .
4.3 Repressão catabolita específica da glicose em H. marismortui
Haloarcula marismortui mostrou crescimento diauxico em misturas glicose/acetato com glicose como substrato preferencial indicando algum tipo de repressão catabólica da utilização do acetato pela glicose. A repressão de catabolitos específicos da glicose não foi analisada até o momento na Arcaéia. Em bactérias a base molecular da repressão de catabolitos de carbono pela glicose tem sido estudada em detalhe, por exemplo, em E. coli e B. subtilis. Durante o crescimento de C. glutamicum em misturas glucose/acetate monofásico foi descrito com consumo simultâneo de acetato e glucose, enquanto que em Azotobacter vinelandii acetato é o substrato preferido. Os princípios regulatórios por trás dessas características são atualmente investigados .
Outros estudos são necessários para substanciar a proposta de regulação específica do substrato de formação de acetato e enzimas ativadoras de acetato, ACD e ACS, em relação ao metabolismo do acetato e da glicose no nível transcripcional. Estes estudos, que requerem a purificação e identificação dos genes codificadores do ACD e ACS de H. marismortui estão em curso.
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Author notes
Editor: Dieter Jahn
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