- Abstract
- 1. Introdução
- 2. Resultados e Discussão
- 2.1. Síntese de derivados 4-hidroxicumarínicos
- 2.1.1. Síntese de Arylmethylene-β-Ketoesters
- 2.1.2. A adição de Michael de Arylmethylene-β-Ketoesters e Arylmethylene-2,4-Pentanediones a 4-Hidroxicumarina
- 2.2. A interação da protease HIV-1 por acoplamento molecular com alguns novos derivados de 4-hidroxicumarina sintetizados foi investigada. Dados experimentais para a atividade de algumas 4-hidroxicumarinas foram utilizados para comparação.
- 2.3. Atividade Biológica em Cultura Celular (Células MT-4)
- 3. Conclusão
- 4. Parte Experimental
- 4.1. Síntese de derivados de 4-hidroxicumarina
- 4.1.1. Materiais e Métodos
- 4.1.2. Procedimento geral para a preparação de Arylmethylene-β-Ketoesters
- 4.1.3. Procedimento para a preparação de 3-(4-Hidroxi)-Fenilmetileno-2,4-Pentandiona (6)
- 4.1.4. Procedimento Geral para a Preparação de Produtos de Condensação com 4-Hidroxicumarina
- 4.1.5. A adição de Michael entre 3-(4-Hidroxibenzilideno)-2,4-pentanodiona (SS-23) e 4-Hidroxicumari
- 4.2. Acoplamento Molecular
- 4.3. Linhas Celulares e Vírus
- 4,4. Testes de citotoxicidade e ensaios antivirais em cultura celular
- 4.4.1. Atividade endógena de RT e Efeito direto dos Compostos sobre RT
- 4.4.2. Detecção da atividade antiprotease por testes usando PR nativo viral
Abstract
Seis novos derivados de 4-hidroxicumarina foram racionalmente sintetizados, verificados e caracterizados por acoplamento molecular usando protease cristalina HIV-1. Os estudos de acoplamento molecular previram a atividade antiprotease de (7) e (10). Os grupos funcionais mais significativos, responsáveis pela interação com a protease HIV-1 pela formação de ligações de hidrogênio são o oxigênio piramidal, o átomo, o oxigênio carbonilo da lactona e um dos grupos hidroxila. Os compostos recentemente sintetizados foram testados biologicamente em células MT-4 para inibir a replicação do HIV-1, explorando a proteção das células contra o efeito citopático do HIV medido pela sobrevivência celular no teste MTT. Uma derivada -7 mostrou 76-78% de inibição da infecciosidade do vírus com IC50 = 0,01 nM, muito menor que a concentração máxima não tóxica (1 mM). A atividade antiprotease de 7 em duas concentrações diferentes foi detectada como sendo de 25%. No entanto, os resultados do estudo de (7) estimulam o seu uso como farmacóforo para posterior síntese e avaliação da atividade anti-HIV.
1. Introdução
A protease retroviral (PR) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é uma das principais enzimas para a replicação do vírus. Ela cliva os precursores proteicos e glicoproteicos para produzir enzimas virais activas e proteínas estruturais. O HIV-1 PR inativo leva a viriões não-infecciosos. Este facto estimulou a procura de substâncias potentes com actividade antiprotease que inibem a replicação do HIV-1. Durante os últimos 12 anos, uma série de análogos peptidomiméticos – inibidores do HIV-1 (PIs) – foram clinicamente introduzidos, mas a maior parte deles apresentam fracas características farmacológicas, tais como má biodisponibilidade oral, depuração rápida e problemas de tolerabilidade – frequentemente associados à lipodistrofia e dislipidemia. Além disso, por serem peptidomiméticos, os isolados virais demonstram rapidamente um alto grau de resistência e resistência cruzada, mesmo quando se utilizam os membros do grupo antes da colocação no mercado das IPs .
Desenvolvimento de novas IPs não péptidas, como Tipranavir e Darunavir, mostraram uma potência impressionante contra mutantes resistentes às IPs, permanecendo assim uma opção importante para os pacientes que abrigam tal resistência . Esta é a razão para procurar novos inibidores de substâncias nãopéptidicas da protease HIV-1. Dados experimentais sobre algumas substâncias não-péptidas-4-hidroxicumarinas (Figura 1) e derivados de 4-hidroxipiranos inibidores do HIV-1 PR, apoiam esta ideia .
Estrutura de 4-hidroxicumarina.
Estar durante longos anos interessado na síntese e avaliação de uma série de substâncias não-péptidas como os derivados da 4-hidroxicumarina , fomos encorajados a alargar estas experiências. Aqui, uma série de novas sínteses são apresentadas, acompanhadas de experimentos de acoplamento molecular usando enzimas cristalinas e avaliação da atividade biológica de novos e promissores derivados da 4-hidroxicumarina.
2. Resultados e Discussão
2.1. Síntese de derivados 4-hidroxicumarínicos
2.1.1. Síntese de Arylmethylene-β-Ketoesters
Aldeídos aromáticos diferentes são utilizados para síntese de arylmethylene-β-ketoesters via reação de Knoevenagel com acetoacetato de etila na presença de piperidina como agente básico e ácido acético glacial. Esses ésteres de arilmetileno-β-cetoesters podem ser apresentados como na Figura 2.
Reacção de 4-hidroxibenzaldeído e 2,4-pentanodiona também foi realizada nas mesmas condições que as acima mencionadas. O produto isolado foi 3-(4-hidroxi)fenilmetileno -2,4-pentanodiona (6) , ver Figura 3.
Síntese de 3-(4-hidroxi)fenilmetileno-2,4-pentanodiona (6).
2.1.2. A adição de Michael de Arylmethylene-β-Ketoesters e Arylmethylene-2,4-Pentanediones a 4-Hidroxicumarina
A segunda etapa da reação é uma adição dos arylmethylene-β-ketoesters obtidos com 4-hidroxicumarina através da reação de Michael, usando metóxido de sódio ou piperidina como agente básico . Esta reação pode ser expressa como na Figura 4.
A adição de 4-hidroxicumarina e de arilmetileno-β-ketoesters pelo Michael.
A adição de 4-hidroxicumarina e 3-(4-hidroxi-)fenilmetileno-2,4-pentanodiona de Michael (6).
2.2. A interação da protease HIV-1 por acoplamento molecular com alguns novos derivados de 4-hidroxicumarina sintetizados foi investigada. Dados experimentais para a atividade de algumas 4-hidroxicumarinas foram utilizados para comparação.
O acoplamento molecular preliminar foi feito com base nos derivados conhecidos da 4-hidroxicumarina, que têm atividade inibidora da protease do HIV-1 (Tabela 1) . A grade é escolhida para sobredimensionar o ligante que está previamente ligado à enzima (neste caso foi escolhido 7 Å de tamanho da grade).
Os valores das funções 𝐺-score e E-model foram obtidos por este método. Eles são chamados de scoring function e são equivalentes abstratos do Δ𝐺bind. Estas funções levam em conta a energia livre devido aos efeitos solventes, mudanças conformacionais na proteína e no ligando, interações entre a proteína e o ligando (ligações de hidrogênio, interação iônica e forças de van der Waals), perda de energia livre do congelamento da rotação interna da proteína e do ligando, perda de energia livre na energia translacional e rotacional, causada pela associação das duas moléculas, e a energia livre devido a mudanças no modo vibracional (geralmente ignoradas). Se estes valores forem mais negativos para um ligando, isto significa que a capacidade de ligação deste ligando é melhor. Quando o ligando mostra capacidade de ligação em uma determinada conformação, o programa mostra isso como uma “boa pose”.
Esta enzima consiste em duas cadeias de polipeptídeos e é da família dos proteases aspartílicos com dois resíduos de aspartato deitados no fundo do local ativo. Utilizamos a estrutura cristalográfica da protease retroviral HIV-1, ligada com um inibidor peptidomimético BEA369 do Banco de Dados de Proteínas com código pdb 1EBY.
Pode-se concluir que o ligando (1) tem a mais forte capacidade de ligação à protease do HIV-1. Os resultados do acoplamento molecular confirmam os dados experimentais sobre ligando (1).
Ligandos (1)-(5), os valores do modelo 𝐺 e E do acoplamento molecular, para o grupo de compostos testados, são mostrados na Tabela 2.
As interações entre os derivados de 4-hidroxicumarina investigados e os locais ativos da enzima protease HIV-1 são realizadas pela ligação de hidrogênio e as interações van der Waals. O composto mais ativo, por exemplo, com a melhor atividade de ligação, é o composto (10), de acordo com ligandos (1)-(4) (com base nos valores das funções de pontuação). Este fato provavelmente se refere a uma formação de ligações de hidrogênio entre o átomo de oxigênio pyran, o oxigênio carbonil lactona e um dos grupos hidroxil (em metaposição) ligado ao anel aromático da cadeia lateral. As forças de atração dos van der Waals também contribuem para uma boa ligação. Segundo Ligand (5), o mais activo é o composto (7). Existem duas ligações de hidrogénio para o composto (7) com a participação do átomo de oxigénio pyran, do átomo de oxigénio carbonilo do anel de lactona e um e correspondentes fragmentos de proteínas. As interações de atração van der Waals, nas quais provavelmente o grupo m-nitro está participando com um de seus átomos de oxigênio, são substanciais para a ligação. O composto (7) parece ser mais ativo que os ligandos experimentais.
2.3. Atividade Biológica em Cultura Celular (Células MT-4)
Após demonstrar a atividade de alguns derivados de 4-hidroxicumarina em direção ao HIV-PR isolado em experimentos de acoplamento molecular, seria de interesse testá-los em células MT-4 infectadas pelo HIV-1. A avaliação do efeito anti-HIV foi feita por um ensaio in vitro de infecção rápida e sensível por microtitulação, baseado na quantificação da citólise por meio da absorção do corante vital (MTT) como desfecho da infecção. Adicionalmente, o efeito dos inibidores na atividade da transcriptase reversa endógena (RT) dos sobrenadantes MT-4 infectados pelo HIV-1 III B foi considerado como um marcador para a capacidade de bloquear a replicação do HIV-1. As células MT-4 foram infectadas e incubadas com cada inibidor por 72-96 horas, e então a atividade de RT foi medida nos sobrenadantes celulares de acordo com as diretrizes do ensaio HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suécia). Também foi realizado um estudo do efeito direto das 4-hidroxicumarinas recentemente sintetizadas sobre a RT exógena recombinante (rRT). Além disso, todos os compostos foram testados para actividade anti-HIV-1 PR. A tabela 3 representa os resultados do ensaio de infecção por microtitulação usando MTT e inibição da atividade PR do HIV-1. Os experimentos foram realizados em concentração máxima não tóxica (MNC) para cada composto.
Primeiro de todos, observa-se que os compostos (8), (7), e (12) têm MNC mais alto, significando que são mais citotóxicos do que os outros três compostos. Apenas dois deles (10) e (7) inibiram a replicação viral nas células MT-4, a inibição induzida por (7) foi notável (78%). Usando diluições virais de 10x, a IC50 foi estabelecida em 0,01 nM. Nenhum composto mostrou efeito tanto na RT endógena quanto na exógena. Isto significa que a RT não foi o alvo da ação antiviral. Como previsto pelos estudos de acoplamento molecular, a atividade de RP do HIV-1 foi inibida 24-25% foram por (7) (5 avaliações separadas foram feitas). A discordância encontrada para (7) entre os dados relativos à inibição da infecciosidade (cerca de 75%) e a atividade protease (25%) poderia ser explicada por outra atividade, como a l anti-integrase. É bem conhecido que alguns derivados de 4-hidroxicumarina são inibidores da integrase.
Os experimentos descritos neste trabalho expandem os relatados anteriormente que os derivados da 4-hidroxicumarina poderiam servir como novos inibidores não epépticos. Assim como o tipranavir e o darunavir, eles poderiam ser eficazes em pacientes com resistência desenvolvida ao IPI peptídeo. Especialmente, (7) poderiam ainda ser usados como farmacoforese para sintetizar novos derivados mais ativos em direção à protease HIV-1.
3. Conclusão
Seis compostos de 4-hidroxicumarina foram sintetizados por síntese em duas etapas. O primeiro passo é a reação de Knoevenagel entre aldeídos aromáticos e acetoacetato de etila ou acetilcetona. O segundo passo é a adição de Michael do arylmethylene-β-ketoester obtido ou arylmethylene-2,4-pentanedione com 4-hidroxicumarina. Os produtos são identificados e caracterizados por 1H NMR, EI-MS, FTIR, e análise de elementos.
Estudo da sua actividade de ligação ao HIV-1 PR foi realizado por acoplamento molecular. Foi utilizado o cristal HIV-1 PR, ligado com inibidor peptidomimético BEA369. A maior atividade de ligação está mostrando composto (10), de acordo com os ligandos experimentais (1), (2), (3) e (4) e composto (7), de acordo com o ligando 5. Este fato provavelmente se deve à formação de ligações de hidrogênio entre o átomo de oxigênio de pirâmide, o oxigênio carbonilo de lactona e um dos grupos hidroxila (em metaposição) ligado ao anel aromático a partir da cadeia lateral. As forças de atração de van der Waals também contribuem para uma boa ligação.
Todos os seis compostos foram testados para atividade anti-HIV-1 PR em células MT4 infectadas pelo HIV-1. A sobrevivência celular foi avaliada pelo teste MTT e também foi medida a % de inibição de PR do HIV-1. A maior inibição da PR do HIV-1 (25%) e a maior sobrevida celular MT4 (78%) foram demonstradas pelo composto (7). O composto (7) poderia ainda ser usado como um farmacóforo para sintetizar novos derivados mais ativos para o HIV-1 PR.
4. Parte Experimental
4.1. Síntese de derivados de 4-hidroxicumarina
4.1.1. Materiais e Métodos
Todos os materiais de partida foram adquiridos da Merck, Sigma-Aldrich, e Fluka. Eles são usados sem purificação adicional. Os pontos de fusão são medidos em tubos capilares abertos em um aparelho de ponto de fusão Büchi 535. Os espectros de IR foram registrados no espectrômetro Shimadzu FT-IR 8101 M em nujol, e as freqüências são expressas em cm-1. Os espectros de 1H NMR foram registrados em Brucker 250 MHz em DMSO-d6 ou acetona usando TMS como padrão interno (os desvios químicos são relatados em unidades ppm, constantes de acoplamento (𝐽) em Hz). As abreviações são as seguintes: s: singlet, d: doublet, dd: double doublet, dq: double quartet, dqui: double quintet, t: triplet, e m: multiplet.
MASs-spectral analysis was performed by electronization on masspectrometer Hewlett-Packard 5973 at 70 eV.
4.1.2. Procedimento geral para a preparação de Arylmethylene-β-Ketoesters
Aldeído aromático e etillacetoacetato em quantidades equimolares são misturados em um frasco de fundo redondo. Piperidina (0,03 mol) e ácido acético glacial (0,04 mol) também são adicionados à mistura de reação. Este último é agitado à temperatura ambiente durante 90 minutos. Depois de 20 mL de éter e/ou 150 mL de água destilada são adicionados à mistura de reação, os cristais com cores diferentes são formados. Estes cristais são filtrados e lavados. Em seguida, são secos à temperatura ambiente e recristalizados em solventes apropriados – principais álcoois (etanol, propanol e 2-propanol) e água.
4.1.3. Procedimento para a preparação de 3-(4-Hidroxi)-Fenilmetileno-2,4-Pentandiona (6)
4-Hidroxibenzaldeído (3,66 g, 0,03 mol) e acetilacetona (5,14 mL, 0,05 mol) são misturados em frasco de fundo redondo. Piperidina (0,03 mol) e ácido acético glacial (0,04 mol) também são adicionados à mistura de reação. Este último é agitado à temperatura ambiente durante 120 minutos. Depois de 150 mL de água destilada são adicionados à mistura de reação. Forma-se cristais com cores diferentes. Estes cristais são filtrados e lavados. Depois são secos à temperatura ambiente e recristalizados em cloreto de metileno.
4.1.4. Procedimento Geral para a Preparação de Produtos de Condensação com 4-Hidroxicumarina
Arylydene-β-ketoester, obtidos na reação anterior, e 4-hidroxicumarina são misturados em quantidades equimolares em 25-30 mL de metanol (usado como solvente). O metóxido de sódio (0,003 mol), como agente básico, também é adicionado aos reagentes. A mistura de reação é fervida e agitada durante 60 horas sob refluxo. A reacção é controlada por TLC (hexano : acetona = 2 : 1 ou hexano : acetona : clorofórmio : metanol = 5 : 3 : 2 : 1). Quando as quantidades de reagentes estão esgotadas, o aquecimento foi interrompido. O resíduo da mistura de reação foi filtrado e lavado com água quente, a fim de remover para a 4-hidroxicumarina que não reagiu. Depois disso, o resíduo é seco à temperatura ambiente e recristalizado em solvente apropriado (metanol, etanol, ou 2-propanol).
4.1.5. A adição de Michael entre 3-(4-Hidroxibenzilideno)-2,4-pentanodiona (SS-23) e 4-Hidroxicumari
3-(4-Hidroxibenzilideno)-2,4-pentanodiona (1,02 g, 0,005 mol) e 4-hidroxicumarina (0,81 g, 0,005 mol) são misturadas em ligeiro excesso de 4-hidroxicumarina em 15-25 mL de metanol. A piperidina (0,003 mol) como agente básico também é adicionada aos reagentes. A mistura de reacção é fervida e agitada durante 60 horas sob refluxo. A reacção é controlada por TLC (hexano : clorofórmio : ácido acético = 10 : 10 : 4, hexano : clorofórmio : ácido acético = 10 : 10 : 2, hexano : acetona = 2 : 1). Quando as quantidades de reagentes estão esgotadas, o aquecimento foi interrompido. O resíduo da mistura de reacção foi filtrado e lavado com água quente, a fim de remover a 4-hidroxicumarina que não reagiu. Depois disso, o resíduo é seco à temperatura ambiente e recristalizado em acetona.
4.2. Acoplamento Molecular
Todos os cálculos de acoplamento molecular são realizados com os programas Maestro Macromodel Glide da embalagem Schrodinger . Todas as estruturas (testadas experimentalmente e novas) são minimizadas pelo programa Macromodel, usando o campo de força OPLS2005 e 5000 iterações. A estrutura de raios X da enzima protease HIV-1, juntamente com o inibidor BEA369, é obtida do Banco de Dados de Proteínas com o código PDB 1EBY.
4.3. Linhas Celulares e Vírus
MT-4-uma linha celular de suspensão linfoblastóide humana, gentilmente cedida pelo Gianfranco Pancino- Institute Pasteur, (Unite de Regulation des Infections Retrovirales, Paris, França) representam um modelo clássico de infecção produtiva experimental com a cepa HIV-1 III B e usada como alvo de rotina para o estudo do efeito de inibidores putativos do HIV em cultura celular.
Como fonte do HIV-1, foram utilizados sobrenadantes da linhagem H9/HTLV III B – um presente do Dr. R. Gallo (NIH, EUA)-. Os sobrenadantes foram coletados e centrifugados para remover as células, e os estoques de vírus foram preparados com conteúdo conhecido de antígeno p24 (460 pg/mL, teste Murex HIV Antigen mAB), atividade RT (565,3 pg RT/mL, HS-Lenti RT Activity Kit, Cavidi, Suécia), e infecciosidade (2 × 106 virions infecciosos/mL, ensaio de infecção por microtitulação) . As células MT-4 e H9/HTLV III B foram cultivadas em RPMI 1640 suplementadas com 10% FCS (invitrogênio).
4,4. Testes de citotoxicidade e ensaios antivirais em cultura celular
Os compostos em estudo foram primeiramente dissolvidos em DMSO e posteriormente diluídos em meio de crescimento celular sem soro fetal. Todas as soluções foram preparadas ex tempore.
Os seguintes parâmetros foram estudados: concentração citotóxica 50-CC50, onde possível (a concentração que evita a morte de 50% das células MT-2), concentração máxima não tóxica-MNC, e concentração inibitória 50-IC50 (concentração que inibe em 50% a replicação viral). CC50 e MNC foram detectados pelo ensaio de absorção de MTT . IC50 foi estudado em células MT-4 pelo ensaio de infecção por microtitulação explorando a protecção das células do efeito citopático do HIV medido pelo teste MTT . Experimentos sob condições de infecção aguda foram realizados em microplacas de 96 poços com 6-8 paralelos/experimento. Controles celulares (células MT-4 apenas com meio) e controles virais (células MT-4 infectadas pelo vírus) foram realizados com cada experimento. Para os ensaios de antivírus, o HIV foi adicionado a cada poço para obter uma multiplicidade de infecção 0,1, exceto os controles celulares. A fixação do vírus foi permitida por uma hora a 37°C/5% de CO2. As placas foram incubadas durante 72-96 horas a 37°C/5% de CO2. Depois disso, o teste MTT foi realizado conforme descrito e a absorvância das células viáveis foi medida colorimetricamente a A540 nm. Para todos os experimentos, o valor médio de cada coluna foi calculado (somente se os valores em A540 não diferirem em ±10%). Para os ensaios antivirais, os valores médios das linhas experimentais e de controle foram comparados e a porcentagem de células protegidas (sobrevivência celular) sob a concentração apropriada da substância foi plotada contra a concentração da substância para obter IC50. A sobrevivência celular (% de proteção celular) foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: =%cellprotectionA540𝑋-A540ControlHIVA540CellControlA540ControlHIV×100,(1) onde 𝑋 é o valor médio de A540 de células infectadas com HIV tratadas com concentração apropriada do composto em estudo; HIV controle é o valor médio de A540 de células infectadas com HIV sem nenhum composto adicionado; controle celular é o valor médio de A540 de células não infectadas e não tratadas com células inibidoras.
Como substância referente, foram utilizados ABC (Abacavir conhecido inibidor de transcriptase reversa de nucleosídeos-NRTI) e pepstatina.
4.4.1. Atividade endógena de RT e Efeito direto dos Compostos sobre RT
Foi testado pelo ensaio HS-Lenti Kit-RT (Cavidi, Suécia). O kit contém o RT recombinante (rRT) como padrão, o que torna possível a quantificação do RT. Para o ensaio de RT endógena, foram testados sobrenadantes de células MT-4 infectadas/ não infectadas pelo HIV-1 após a incubação com/sem compostos, de acordo com as directrizes do fabricante. O nível de atividade de RT em sobrenadantes foi calculado (em pg/mL) a partir do padrão de RT do HIV-1 estabelecido em cada kit. O efeito direto dos compostos sobre a atividade de rRT foi medido com o mesmo kit e teve como objetivo provar a RT como um alvo de ação antiviral. Diluições apropriadas do inibidor foram preparadas em tampão de controle e adicionadas à mistura de reação. A reação foi executada por 3 horas a 33°C. A atividade de RT de diluições padrão foi comparada àquela onde foram adicionados compostos ou controles (onde apenas mistura de incubação sem compostos foi adicionada).
A método descrito anteriormente por Broglia et al., 2006 , para detecção de atividade protease recombinante foi modificado para usar protease viral nativa . Como uma fonte de protease nativa HIV-1, novamente foi utilizada a suspensão de estoque viral concentrado (50x) de sobrenadantes de células H9/HTLV IIIB cronicamente infectadas. A lise das partículas virais e a liberação da enzima ativa (protease) foi realizada utilizando tampão disruptor (lise) contendo 2,5% de Triton X-100 em tampão fosfato. A concentração do fluido de cultura de tecidos contendo o vírus foi feita por ultracentrifugação em Biofuga Stratos, Heraeus, durante 1 hora, a 4°C e 35000 rev/min. O sedimento foi ressuspenso para obter 50x de concentrado em tampão disruptor.
A seguinte mistura de reacção foi preparada para cada experiência : 1000 𝜇L tampão fosfato (20 mM, pH 6.0); 20 𝜇L substrato protease HIV III (1 𝜇g/mL, 760 𝜇M; Bachem, Suíça) em DMSO, preparado ex tempore; 20 μL enzima (estoque de HIV) retirada de uma solução contendo 25 𝜇L tampão disruptor (lise) + 100 μL estoque de HIV, incubado 40 min a 37°C antes do experimento.
A actividade do HIV-1 PR foi medida utilizando a leitura espectrofotométrica directa da utilização do substrato de reacção enzimática a 300 nm, à temperatura ambiente e com 1 cm de comprimento, utilizando o espectrofotómetro T80 + UV-Vis (instrumentos PG). A velocidade inicial da reação (V0) foi ajustada para 0,0020-0,0030 ΔAbs/min através da variação da atividade enzimática (concentração viral). O composto testado e o inibidor de referência (pepstatina utilizada aqui) foi adicionado à mistura de reação antes da enzima, a fim de realizar a triagem para efeito inibitório. IC50 foi definido como a concentração do composto testado que diminui a velocidade da reação em 50% da velocidade inicial sem o composto testado (referência).