Acetilcolina é sintetizada a partir da acetil coenzima A e colina pela enzima acetiltransferase de colina. No sistema nervoso, pensa-se que esta enzima existe principalmente no citoplasma terminal do nervo. A coenzima A é sintetizada na mitocôndria e acessa a acetiltransferase de colina após o transporte através da membrana mitocondrial para o citoplasma. Além de sua síntese no fígado, a colina empregada na produção de acetilcolina é derivada de fontes dietéticas. Existe um sistema portador nas células endoteliais capilares que é responsável pelo transporte da colina, nas suas formas livre e fosfolipídica, para o cérebro. A hidrólise de fosfolipídios contendo colina também pode liberar a colina que é usada na síntese de acetilcolina. Como a acetiltransferase de colina não é saturada por concentrações de acetil coenzima A e colina que se estima estarem presentes no terminal nervoso, parece que a taxa de síntese de acetilcolina depende da disponibilidade de precursores. A actividade enzimática também é regulada pela inibição do produto; ao ligar-se num local alostárico à acetil-transferase de colina, a acetilcolina inibe a sua actividade. Além disso, a ação da massa e a atividade neuronal influenciam a taxa de formação da acetilcolina. A regulação a curto prazo da atividade enzimática é parcialmente conseguida pela fosforilação induzida pelas proteínas quinases. Não há inibidores muito específicos e potentes da enzima e deve-se notar que o bloqueio farmacológico desta etapa (por exemplo, com naftilvinilpiridina) no ciclo de vida da acetilcolina produz um efeito menos profundo no transmissor do que a inibição do transporte da colina.
Um transportador específico de acetilcolina de baixa afinidade é responsável pela absorção do transmissor do citoplasma em vesículas. Os genes da acetiltransferase de colina e do transportador vesicular de acetilcolina estão organizados em um único locus genético, e a transcrição dos dois genes é tipicamente co-regulada. O (±)-Vesamicol é um inibidor seletivo deste transportador, sendo o L-(-)-vesamicol mais potente que o D-(+)-vesamicol. Uma vez embalado em vesículas, a acetilcolina está sujeita à liberação induzida por estímulos por exocitose. Várias toxinas poderosas impactam na liberação de acetilcolina, notadamente a toxina botulínica que inibe sua liberação.
Acetilcolinesterase neuronal inativa muito rapidamente a maioria da acetilcolina liberada no cérebro, embora a butirilcolinesterase contida nas células da glial possa hidrolisar uma pequena proporção de acetilcolina na sinapse. Na periferia, a acetilcolinesterase está presente nos músculos que recebem a inervação colinérgica, enquanto a butil-colinesterase está mais amplamente distribuída. Uma série de inibidores reversíveis (por exemplo, fisostigmina, BW284C51) e irreversíveis (por exemplo, iso-OMPA) da acetilcolinesterase são conhecidos, e estes medicamentos têm o efeito de prolongar os efeitos sinápticos da acetilcolina. Anti-colinesterases reversíveis de segunda geração como o donepezil, rivastigmina (ENA 713), eptastigmina e galantamina (galantamina) estão sendo empregados como tratamentos para a doença de Alzheimer. Algumas colinesterases de segunda geração foram retiradas do uso clínico devido a efeitos colaterais inaceitáveis (por exemplo, tacrina, metrifonato). Os inibidores irreversíveis da acetilcolinesterase são utilizados como insecticidas e agentes de guerra química. A colina, que é liberada da acetilcolina pela acetilcolinesterase, é levada de volta para terminais colinérgicos por um transportador de alta afinidade, e reutilizada na síntese do transmissor. O hemicolínio-3 inibe potente e reversivelmente o transporte da colina, e isto resulta numa diminuição profunda na formação da acetilcolina. Ao contrário do hemicolínio-3, o A-4 (um análogo bis 4-metilpiperidina de HC-3), é ativo após a administração periférica. Os análogos de mostarda de nitrogênio da colina são potentes inibidores irreversíveis da absorção de colina de alta afinidade.