Expressão de proteínas, purificação e procedimentos de ensaio de hAASS-SDH
Vector: pFB-LIC-Bse
Linha de células: DH10Bac
Tags e adições: N-terminal, TEV protease clivável hexahistidine tag
Construir sequência proteica:
MGHHHHHHSSGVDLGTENLYFQ*SMALPDKYKYIQTLRESRERAQSLSMGTRRKVLVLGSGYISEPVLEYLSRDGNIEITVGSDMKNQIEQLGKKYNINPVSMDICKQEEKLGFLVAKQDLVISLLPYVLHPLVAKACITNKVNMVTASYITPALKELEKSVEDAGITIIGELGLDPGLDHMLAMESIDKAKEVGATIESYISYCGGLPAPEHSNNPLRYKFSWSPVGVLMNVMQSATYLLDGKVVNVAGGISFLDAVTSMDFFPGLNLEGYPNRDSTKYAEIYGISSAHTLLRGTLRYKGYMKALNGFVKLGLINREALPAFRPEANPLTWKQLLCDLVGISPSSEHDVLKEAVLKKLGGDNTQLEAAEWLGLLGDEQVPQAESILDALSKHLVMKLSYGPEEKDMIVMRDSFGIRHPSGHLEHKTIDLVAYGDINGFSAMAKTVGLPTAMAAKMLLDGEIGAKGLMGPFSKEIYGPILERIKAEGIIYTTQSTIKP
(sequência sublinhada contém vector codificado His-tag e TEV local de clivagem protease*)
Células colhidas foram ressuspendidas em tampão de lise (50 mM HEPES pH 7.4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP, 1 µL por 1 mL de coquetel inibidor de protease livre de EDTA).
Pelete de célula foi dissolvido em aproximadamente 200 mL de tampão de lise e quebrado pela homogeneização por 2 passagens a 12.000 psi. Os resíduos celulares foram granulados a 35000 x g, 1h e o sobrenadante usado para purificação em uma coluna de Ni-NTA (5 mL).
Buffers usados são detalhados a seguir;
Buffer de ligação: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 20 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Buffer de lavagem: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 40 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
Tampão de Eluição: 50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 5% Glicerol, 250 mM Imidazol pH 7,4, 0,5 mM TCEP
O extrato de célula clarificada foi adicionado a 5 ml de resina Ni-NTA pré-equilibrada com tampão de lise e passada através de uma coluna de vidro. A coluna foi então lavada com tampão de ligação (2 x 50 mL) e Wash Buffer (2 x 50 mL). A proteína foi eluída com Tampão de Eluição em frações de 5 x 5 mL. As frações eluídas da coluna 1 foram agrupadas e concentradas em 5 mL com um concentrador de spin de 30 kDa MWCO e injetadas em uma coluna S200 16/60 (pré-equilibrada em tampão GF (50 mM HEPES pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,5 mM TCEP, 5% Glicerol)) a 1,0 mL/min. Foram coletadas frações de 1,5 mL. A proteína eluida foi clivada durante a noite a 4 °C pela protease TEV (1/20 (p/p)). A amostra de proteína do dia seguinte foi carregada em 0,5ml de Ni-sepharose na coluna pré-equilibrada com tampão GF para remover a proteína não eluídas. As frações de proteína agrupadas foram concentradas a 13 mg/mL usando um concentrador mwco de 30 kDa.
Atividade e triagem
Atividade SDH de hAASS foi medida seguindo a redução de NAD+ para NADH, aproveitando que a forma reduzida de NADH é fluorescente quando excitado com luz de 340 nm. Adotamos o ensaio no formato 384 poços, com detecção usando o leitor de fluorescência PheraStar (BMG Labtech) (Excitação/Emissão = 340/480 nm). Este ensaio deu uma resposta linear com concentração de proteínas até 150 nM. Uma reacção típica consiste em 100 nM de enzima purificada, 0,2 mM NAD+, 1,3 mM de sacaropina. O tampão de reacção consiste em 25 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% CHAPS. As bibliotecas compostas (LOPAC (Sigma) e NIH Clinical Collections I&II) foram examinadas internamente em 20 μM concentração composta.
Differencial scan fluorimetry
DSF foi realizada em uma placa de 96 poços utilizando uma máquina Mx3005p RT-PCR (Stratagene) com filtros de excitação e emissão de 492 e 610 nm, respectivamente. Cada poço consistiu de 2 µL de proteína em tampão DSF 2 µM (150 mM NaCl, 10 mM HEPES pH 7,5), 2 µL SYPRO ORANGE diluído 1000 vezes em tampão DSF do estoque do fabricante (Invitrogen), e (se aplicável) 2 µL de ligante em várias concentrações. As intensidades de fluorescência foram medidas de 25 a 96°C com uma taxa de rampa de 3°C/min.
Crystallization
Apo cristais foram preparados misturando 50 nL de proteína hAASS-SDH (80 mg/mL) com 100 nL de solução de reservatório contendo 20% de PEG3350, 0,1M Tris pH 7,5 e 0,2-0,33 M de malonato de sódio. Os cristais ligados ao NAD+ foram preparados misturando 100 nL de hAASS-SDH (18 mg/mL, em excesso molar de NAD+) com 50 nL de solução de reservatório contendo 25% de PEG3350, 0,2M de NaCl e 0,1M de Tris pH 8,5. Os cristais foram crio-protegidos em 9% de butanodiol antes do congelamento em nitrogênio líquido. Para a campanha de triagem dos fragmentos, os cristais foram embebidos com compostos (10/50/500 mM) na solução de cristalização suplementada com 8% de butanodiol durante 5-30 min, e congelados em nitrogênio líquido.
Procedimentos de determinação da estrutura
hAASS-SDH apo e os cristais ligados a NAD+ pertencem a diferentes grupos espaciais (P43212 vs P212121). A estrutura do hAASS-SDH foi resolvida por substituição molecular com o programa PHASER, utilizando como modelo de busca a sacaropina redutase fúngica de S.cerevisiae (código PDB 2AXQ) (38% de identidade sequencial). Duas moléculas foram encontradas na unidade assimétrica (a.u.). O modelo inicial foi reconstruído usando fenix.autobuild. Uma molécula de NAD+ ligada no local ativo foi identificada pelo método de Fourier por diferença e colocada manualmente na densidade de elétrons usando Coot. Para completar o modelo foram realizados ciclos iterativos de fenix.refine incluindo refinamento de TLS seguido de construção manual do modelo para resíduos ausentes usando coot. Nenhuma restrição NCS foi aplicada devido a diferenças conformacionais no domínio III (res 278-376) das duas cópias na a.u. Os átomos de solvente foram colocados durante as últimas quatro rodadas de refinamento usando fenix.refine. Para a campanha de triagem dos fragmentos, os ligandos foram identificados por DIMPLE (8)(https://github.com/ccp4/dimple) usando mapas de densidade de diferença. Ligantes fracos com baixa ocupação foram avaliados usando PANDDA (9)(https://pandda.bitbucket.io/), baseado em modelos estatísticos para encontrar densidade de ligantes presente em um dado conjunto de dados que não está presente na maioria dos conjuntos de dados. As coordenadas e fatores de estrutura para todos os conjuntos de dados são depositadas no banco de dados de proteínas RCSB. A recolha de dados e estatísticas de refinamento estão disponíveis nas páginas do PDB.
Reagentes disponíveis comercialmente
CRISPR/Cas9 knockout plasmids
SCBT: Cat # sc-406408
Genscript: Gato # 10157