O padrão ouro para o diagnóstico de alergia alimentar é o desafio alimentar oral (OFC) . No entanto, o OFC requer a ingestão do alimento suspeito e pode causar uma reacção alérgica aguda, que é potencialmente grave . Por este motivo, o OFC precisa ser realizado em um ambiente supervisionado com as instalações e a experiência para tratar reações alérgicas e anafilaxia, caso elas ocorram. A OFC pode causar ansiedade significativa em pacientes, pais e até mesmo na equipe clínica, pois envolve risco considerável. Assim, sempre que possível, o diagnóstico de alergia alimentar é estabelecido por um histórico recente e convincente de uma reacção alérgica mediada por IgE ao alimento culpado, combinado com provas de sensibilização à IgE para o mesmo alimento através de um teste de punção cutânea (SPT) e/ou IgE específico do soro (sIgE) . Os OFC são reservados para os casos em que os resultados de SPT e/ou sIgE são equívocos. Com o aumento da consciência e da prevalência de alergia e sensibilização alimentar, cada vez mais doentes estão a ser testados para alergia alimentar. A ausência de um histórico de exposição oral a alimentos alergênicos, resultando em uma reação alérgica ou na ausência de sintomas clínicos, pode tornar a interpretação dos resultados da SPT e sIgE particularmente desafiadora. Os bebés e crianças pequenas que nunca tiveram certos alimentos alergénicos constituem uma proporção considerável de doentes atendidos em clínicas de alergias e necessitam frequentemente de um OFC para clarificar o seu estado alérgico. Isso resulta em uma demanda crescente no desempenho da OFC. Os serviços de alergia têm dificuldade em responder a esta procura e os doentes podem ter de esperar vários meses antes de lhes ser oferecido um diagnóstico exacto de alergia alimentar ou tolerância alimentar por OFC, o que pode levar a restrições alimentares desnecessárias e a uma ansiedade significativa associada à incerteza do diagnóstico. O OFC é também o padrão ouro para avaliar a resolução da alergia alimentar, para determinar a dose limite e para monitorizar a resposta clínica aos tratamentos imunomoduladores para alergias alimentares. Em estudos de investigação, os doentes alérgicos têm frequentemente de se submeter a OFC repetida para avaliar se houve alguma melhoria clínica.
A BAT, sendo um ensaio funcional, tem o potencial de se assemelhar mais ao fenótipo clínico dos doentes do que os testes de alergia que apenas detectam a presença de IgE específica do alergénio. Em termos simples, a MTD pode ser vista como um OFC num tubo de ensaio, onde em vez de dar o alimento a uma criança pela boca, os basófilos envolvidos em reacções alérgicas agudas são expostos a um extracto alimentar num tubo de ensaio. Apesar da analogia, diferenças entre os dois procedimentos e suas aplicações clínicas podem ser apontadas e aqui se coloca a questão se a BAT pode imitar lealmente a OFC padrão ouro, ou seja, se a BAT pode reproduzir in vitro a reação alérgica que acontece in vivo durante uma OFC positiva.
O teste de ativação de basófilos
A MTD é um ensaio baseado em citometria de fluxo onde a expressão dos marcadores de ativação é medida na superfície dos basófilos após a estimulação com o alérgeno -Fig. 1. Um teste de ativação positiva de basófilos pode ser visto como um substituto in vitro de uma reação alérgica aguda in vivo. Em um estudo de pacientes alérgicos ao veneno do himenóptero, foi observada a up-regulation dos marcadores de ativação de basófilos tanto in vitro após estimulação com jaqueta amarela ou veneno de abelha e ex vivo após um desafio de picada positiva . No mesmo estudo, houve uma concordância geral entre a apresentação clínica (reação sistêmica versus grande reação local) e os resultados da MTD, sugerindo que a MTD é um biomarcador potencial da anafilaxia. Também em pacientes alérgicos a alimentos foi encontrada uma boa concordância entre os resultados da MTD e o resultado da OFC. Em pacientes alérgicos ao alfa-gal com reações alérgicas do tipo imediato atrasadas à carne vermelha, a ativação de basófilos ex vivo no sangue coletado em diferentes pontos de tempo coincidiu com o desenvolvimento de reações alérgicas sistêmicas in vivo durante a OFC . Os resultados deste estudo reforçam o papel dos basófilos nas reações alérgicas mediadas por IgE e anafilaxia induzidas por alimentos.
Diagrama do procedimento laboratorial para o teste de ativação do basófilo. Após estimulação das células sanguíneas com alergênio ou controles, as células sanguíneas são coradas com anticorpos acoplados a um fluorocromo, que permitem a identificação das células e a medição da expressão dos marcadores de ativação usando um citômetro de fluxo
Diferentes marcadores de superfície celular podem ser usados para identificar os basófilos no sangue total, incluindo IgE, CD123 (com HLA-DR), CCR3 ou CRTH2 (com CD3) ou CD203c .
Em sangue periférico, o IgE é detectado em basófilos, células dendríticas, eosinófilos, monócitos, macrófagos, células B e plaquetas, portanto não é específico para basófilos. O CD123 é a subunidade de baixa afinidade (α) do receptor IL-3. Ele é expresso em altos níveis em células plasmocitóides dendríticas e basófilos e em baixos níveis em monócitos, eosinófilos, células mielóides dendríticas e subgrupos de células progenitoras hematológicas. A coloração adicional com HLA-DR discrimina entre basófilos HLA-DR-negativos e células dendríticas HLA-DR-positivas e monócitos. CCR3 é o receptor de quimiocinas tipo C-C (por exemplo, eotaxina, MCP e RANTES) e é altamente expresso em basófilos e eosinófilos, mas também em células Th1 e Th2. CRTH2 é outro marcador que é expresso por basófilos, eosinófilos e células T, e assim como CCR3, requer um marcador de células T, como o CD3, para distinguir basófilos de células T. CD203c é constitutivamente e especificamente expresso em basófilos e, portanto, pode ser usado como um único marcador de identificação ou em combinação com outros marcadores.
A estimulação com alergênios, a expressão de diferentes proteínas é up-regulada na superfície dos basófilos , ou seja, CD63 e CD203c . A CD63 é uma proteína de membrana lisossomal associada (LAMP), que não é expressa na superfície dos basófilos em repouso, mas apenas na membrana dos grânulos dentro das células . Quando os grânulos se fundem com a membrana plasmática dos basófilos durante a desgranulação, a CD63 torna-se expressa na superfície dos basófilos . O CD203c é uma enzima que cliva as ligações fosfodiéster e fosfosulfato, removendo hidroliticamente os nucleotídeos 5′-nucleotídeos sucessivamente dos oligonucleotídeos 3′-hydroxy-termini. É expressa exclusiva e constitutivamente em baixos níveis na superfície dos basófilos e mastócitos e a sua expressão aumenta com a activação celular. Os marcadores de ativação do basófilo parecem formar dois grupos distintos de marcadores que se atualizam concomitantemente: um incluindo CD63, CD107a e CD107b e outro incluindo CD203c, CD13 e CD164 . CD63 e CD203c são os marcadores de ativação de basofil mais comumente usados.
O procedimento laboratorial da MTD consiste em três estágios: estimulação celular, coloração celular e citometria-Fig. 1. O sangue deve ser processado o mais rápido possível após a coleta de sangue, pois os basófilos perdem sua viabilidade e reatividade ao longo do tempo. No entanto, foram realizados estudos com amostras armazenadas a +4 °C até 24 h. É necessário um pequeno volume de sangue (c.a. 1-2 ml, dependendo do número de condições) para a MTD. Podem ser utilizados extractos de alergénios brutos ou alergénios purificados ou recombinantes para a estimulação celular. Diferentes concentrações de alergênios devem ser usadas, pois a sensibilidade dos basófilos à estimulação alergênica específica varia entre os pacientes.
Os resultados da MTD podem ser determinados em termos de percentagem de basófilos expressando o marcador de ativação definido ou em termos de intensidade de fluorescência média (IFM) calculando o índice de estimulação, ou seja, a razão entre a IFM da condição selecionada e a IFM do controle negativo. A primeira é normalmente usada para o CD63, pois o CD63 não é expresso em células em repouso e sua expressão após a ativação é bimodal. O último é normalmente usado para CD203c que já é expresso em células em repouso e seu aumento após a estimulação alergênica é unimodal-Fig. 2.
Traçados de pontos e histogramas mostrando a expressão de CD63 e CD203c na superfície dos basófilos em diferentes condições. Células não estimuladas (controle negativo) e células estimuladas com amendoim ou com anti-IgE (controle positivo) são representadas. A expressão do CD63 é medida como a percentagem de basófilos positivos (painel esquerdo) e a expressão do CD203c é medida como o índice de estimulação (SI), ou seja a relação da intensidade média de fluorescência das células estimuladas e o controle negativo (painel direito)
Em pacientes alérgicos, a ativação do basofil induzida pelo alergênio normalmente resulta em uma curva dose-resposta em forma de sino, com concentrações crescentes do alergênio (geralmente 5-6 log de diferença) levando a um aumento progressivo na expressão dos marcadores de ativação do basofil até atingir um platô-Fig. 3,
Reactividade do basófilo e sensibilidade do basófilo. Dois exemplos de curvas dose-resposta de ativação basofílica após estimulação com várias concentrações de alergênios de dois pacientes diferentes estão representados. A proporção de células CD63+ positivas é uma medida da reatividade basofílica e EC50, a concentração efetiva em 50% da ativação máxima, é uma medida da sensibilidade basofílica
Existe um grande grau de variabilidade na resposta basofílica ao alergênio entre indivíduos. Para expressar essa heterogeneidade e comparar as respostas do basofil entre diferentes pacientes, vários parâmetros podem ser determinados com base na curva dose-resposta, tais como CD-max e EC50 (50 % de concentração efetiva) ou CDens. O CD-max é a ativação máxima e corresponde à proporção máxima de basófilos ativados em qualquer concentração de alergênio . EC50 é a dose efetiva a 50% da ativação máxima, e também pode ser representado como CDens. Primeiro descrito por Johansson , CDsens é o inverso da concentração eficaz meia-máxima, ou seja, a concentração na qual a ativação do basofil é metade da ativação máxima, vezes 100 e pode ser calculada usando a fórmula: CDsens = 1/EC50 × 100. CDmax e CDens são medidas da reatividade do basofil e da sensibilidade do basofil, respectivamente. A reatividade do basofil pode ser definida como o grau de ativação do basofil, ou seja, a proporção de basófilos ativados, e também pode ser medida como a porcentagem de basófilos CD63-positivos em diferentes concentrações de alergênio ou como a proporção da porcentagem de CD63-positivos após estimulação com alergênio e com anti-IgE. A sensibilidade ao basofil refere-se à concentração de alergênio na qual os basófilos tornam-se ativados e pode ser expressa como uma porcentagem da dose máxima efetiva (por exemplo, EC5, EC10), além do EC50 e CDens, anteriormente mencionados. A Figura 3 representa a resposta de dois indivíduos diferentes, um com maior reatividade e sensibilidade basofílica (azul) e o outro com menor reatividade e sensibilidade basofílica (vermelho), ou seja, com uma proporção menor de basófilos sendo ativados em resposta a maiores concentrações do alergênio. Shreffler e Patil propuseram um novo parâmetro para medir as respostas do basofil, a área sob a curva dose-resposta, que tem a vantagem de combinar reatividade basofil e sensibilidade basofil.
Usando o teste de ativação do basofil para diagnosticar alergias alimentares
Em um estudo recentemente publicado, avaliamos a utilidade da MTD para diagnosticar alergia a amendoim em uma população bem caracterizada de crianças alérgicas a amendoim, sensibilizadas e não sensibilizadas. A BAT mostrou uma alta precisão (97%) no diagnóstico da alergia aos amendoins e permitiu uma redução do número de OFC requerido em 66%. Validámos os cortes de diagnóstico numa população recrutada de forma prospectiva e independente e o desempenho diagnóstico da BAT foi ainda muito bom nesta segunda população do estudo. Nos últimos anos, outros estudos avaliaram o desempenho das MTD no diagnóstico da alergia a diferentes alimentos, incluindo amendoim, leite de vaca, ovo, trigo, avelã, marisco e pêssego, bem como no diagnóstico de síndromes pólen-alimentares – Tabela 1. Relatos de casos e pequenas séries de casos sugerem que a MTD também pode ser útil no diagnóstico de alergia ao sésamo e a elicitors menos comuns de reacções alérgicas alimentares mediadas por IgE, como o arroz e os galacto-oligosacáridos de cadeia curta presentes nos prebióticos . Um artigo de posição recentemente publicado pela Academia Europeia de Alergia e Imunologia Clínica analisa as aplicações clínicas das MTD…
Vários factores podem influenciar o desempenho diagnóstico e os valores de corte das MTD em diferentes estudos, alguns relacionados com a população estudada, alguns relacionados com o desenho do estudo, alguns relacionados com o procedimento laboratorial e com a metodologia adoptada para análise de dados – Tabela 2. Os estudos existentes são heterogêneos na maioria destes aspectos, o que limita a sua comparabilidade e uma aplicação mais ampla dos cut-offs diagnósticos determinados em estudos específicos. O critério para diagnosticar cada alergia alimentar é específico a cada alergénio e a exactidão do diagnóstico pode não ser a mesma para alergénios diferentes. Além disso, os cut-offs definidos numa população não são necessariamente transferíveis directamente para outra população a partir de uma localização geográfica diferente, avaliada num centro de alergias diferente. Uma limitação da MTD é o facto de uma pequena proporção dos doentes testados ter basófilos não respondedores (ou seja, basófilos que respondem a um controlo positivo não mediado por IgE mas não a estimulantes mediados por IgE) e, por isso, têm um resultado ininterpretável para o teste. Os desafios adicionais na tradução da MTD de um método de pesquisa para um teste diagnóstico na clínica estão relacionados com a padronização do ensaio e a sua reprodutibilidade e também com a relação custo-eficácia da inclusão da MTD na abordagem diagnóstica de doentes com suspeita de alergia alimentar. Estes aspectos ainda não foram estabelecidos e requerem mais investigação.
A metodologia adoptada para realizar o procedimento laboratorial e analisar os dados da citometria de fluxo pode ter um impacto significativo nos resultados obtidos para a MTD e, consequentemente, na sua exactidão diagnóstica. Por exemplo, identificar os basófilos usando um anticorpo anti-IgE pode ativar as células e alterar os resultados obtidos com um método diferente para identificar os basófilos. A expressão de certos marcadores de identificação de basófilos, como CCR3 e CD123, pode mudar após a ativação do basófilo. Em um estudo recente, descrevemos que em cerca de um quarto dos pacientes, a expressão de CD123, como detectada pela citometria de fluxo, pode ser reduzida após a ativação do basofil e, portanto, levar a uma perda significativa de células ativadas, utilizando métodos que se baseiam nesse marcador para identificar os basófilos. Isso poderia resultar em um número maior de diagnósticos errôneos, particularmente falsos-negativos, com importantes conseqüências para os pacientes individuais. A adição do marcador específico de basófilos CD203c à estratégia de portões manteve o número de células e permitiu reduzir o número de falso-negativos (de 5 para 1 %). A estratégia modificada de comedouro melhorou tanto a sensibilidade (de 88 a 98%) como a especificidade (de 94 a 96%) da MTD, resultando num aumento global da precisão da MTD para diagnosticar a alergia aos amendoins de 91 a 97%-Fig. 4. A fim de conduzir e interpretar a MTD com sucesso, “o diabo está no detalhe”; portanto, é muito importante considerar cuidadosamente os aspectos metodológicos da MTD.
Aumento da precisão diagnóstica do teste de ativação do basófilo para amendoim usando a estratégia de portas de basófilos SSClow/CD203c+/CD123+/HLA-DR- (em vermelho) comparado ao uso de SSClow/CD123+/HLA-DR- (em azul). Curvas ROC da % média de basófilos CD63+ a 10 e 100 ng/ml de extrato de amendoim usando as duas diferentes estratégias de alimentação
Overall, como teste diagnóstico, a MTD tem mostrado alta especificidade e valor preditivo positivo. Validámos os cut-offs diagnósticos determinados para a alergia aos amendoins numa população independente e prospectivamente recrutada e a especificidade e o valor preditivo positivo da MTD atingiu 100 %. A alta especificidade é uma adição importante aos testes de alergia existentes, como o SPT e o sIgE, que têm uma sensibilidade elevada mas não são muito específicos. A elevada especificidade implica que uma MTD positiva confirma o diagnóstico de alergia alimentar com confiança, mas uma MTD negativa não exclui necessariamente o diagnóstico. Dependendo da relação custo-benefício e aspectos de segurança, a OFC pode ser feita em pacientes onde a MTD fornece um resultado inconclusivo (ou seja, pacientes com basófilos não-respondedores) ou em pacientes onde a MTD fornece um resultado inconclusivo e em pacientes onde a MTD foi negativa.
A abordagem para decidir sobre a necessidade de OFC após a BAT também depende de como o resultado da BAT é considerado no contexto dos resultados de outros testes de alergia, seja em combinação, quando todos os resultados disponíveis são considerados simultaneamente, ou sequencialmente, quando a BAT é realizada apenas em pacientes que tiveram resultados equívocos ou discordantes para os outros testes de alergia. No nosso estudo de amendoim anteriormente citado, comparamos o desempenho da MTD com o de outros testes de alergia feitos em paralelo. A MTD foi melhor que a SPT, a IgE específica ao amendoim e a IgE específica ao Ara h 2 e outros componentes do amendoim. Considerando testes únicos, o teste de diagnóstico mais preciso foi o BAT. A fim de aproveitar ao máximo a informação disponível, os resultados da MTD podem ser usados em combinação com os resultados de outros testes . No entanto, geralmente, quanto mais testes usados, maior a incerteza diagnóstica (e maior o número de OFC), dado que testes diferentes podem fornecer resultados contraditórios . Melhor do que combinar os resultados dos testes de alergia simultaneamente pode ser utilizar a MTD sequencialmente no trabalho de diagnóstico de alergias alimentares, em doentes que tiveram um resultado inconclusivo para os outros testes de alergia . Esta abordagem pode ser vantajosa também do ponto de vista da viabilidade, considerando os aspectos práticos envolvidos no desempenho da MTD, nomeadamente a necessidade de sangue fresco e os recursos e conhecimentos técnicos necessários. Não seria prático ou mesmo necessário realizar MTD em todos os doentes em investigação por suspeita de alergia alimentar. As MTD podem ser reservadas para casos seleccionados, particularmente casos em que não há história de exposição oral ao alimento ou em que a história clínica não é clara e os resultados de SPT e IgE específicos são inconclusivos. As MTD podem ser utilizadas como um segundo passo no trabalho de diagnóstico, seguindo a história clínica e SPT e/ou sIgE, em casos difíceis, antes de decidir se é necessário um OFC -Fig. 5. A precisão diagnóstica e a superioridade da BAT sobre o teste de punção cutânea e IgE específico precisa ser avaliada com outros alergênios e em outros ambientes clínicos.
O teste de ativação do basofil pode ser útil em pacientes selecionados, nos quais a combinação da história clínica e do teste de punção cutânea (SPT) e/ou IgE específico é inconclusiva, antes de se referir ao desafio alimentar oral. Uma MTD positiva confirma o diagnóstico de alergia alimentar e permite adiar o desempenho do OFC. Uma MTD equívoca ou negativa deve ser seguida por OFC para esclarecer o diagnóstico
Parte de distinguir pacientes alérgicos a alimentos e tolerantes a alimentos, os resultados da MTD podem fornecer informações adicionais sobre as características das reações induzidas pelos alimentos que podem ser úteis no manejo de pacientes alérgicos . Diferentes parâmetros da MTD têm demonstrado refletir diferentes características das reações alérgicas, com a proporção de basófilos ativados (reatividade basofílica) refletindo a gravidade dos sintomas alérgicos e a dose na qual os basófilos reagem ao alergênio in vitro (sensibilidade basofílica) refletindo a dose de proteína alimentar na qual os pacientes reagiram durante a OFC . Estes achados na alergia aos amendoins foram reproduzidos em um estudo publicado posteriormente e podem ser aplicáveis a outras alergias alimentares. Em qualquer caso, o resultado da MTD deve ser tomado no contexto de outras características clínicas e fatores de risco de gravidade, ao avaliar pacientes alérgicos aos alimentos.
Usar o teste de ativação do basofil para monitorar a aquisição de tolerância aos alimentos e a resposta clínica aos tratamentos imunomoduladores para alergia alimentar
Refletir de perto o fenótipo clínico dos pacientes alérgicos e tolerantes, As MTD podem ser úteis na avaliação da resolução natural das alergias alimentares que são normalmente ultrapassadas ao longo do tempo, como o leite de vaca, ovos e alergias ao trigo, e na determinação do momento em que se deve voltar a questionar os pacientes para avaliar se os alimentos podem ser reintroduzidos na dieta. A BAT demonstrou distinguir diferentes fenótipos de doentes com leite de vaca e alergias ao ovo, nomeadamente doentes que toleram formas extensivamente aquecidas destes alimentos enquanto ainda reagem aos alimentos não aquecidos de doentes que reagem tanto a leite ou ovo extensivamente aquecidos como não aquecidos .
BAT também tem sido usada para monitorizar a resposta clínica a tratamentos imunomoduladores para alergias alimentares em estudos de investigação. Em geral, em estudos de imunoterapia a alimentos como amendoim, leite de vaca e ovo, a MTD tem mostrado uma menor reatividade do basofil aos respectivos alergênios alimentares com tratamento, o que é particularmente evidente nas menores concentrações do alergênio, refletindo a diminuição da sensibilidade ao basofil. Curiosamente, Thyagarajan et al. mostraram que, durante o amendoim OIT, a redução da ativação do basofil não estava acontecendo apenas em resposta ao amendoim, mas também ao alérgeno do ovo (em pacientes alérgicos ao ovo) e ao anti-IgE, mas não ao controle positivo não mediado pelo IgE, fMLP (formil-metionil-leucil-fenilalanina), sugerindo que o caminho a jusante do receptor IgE tinha se tornado anergico. Em um estudo de omalizumab em pacientes alérgicos a amendoim, a expressão de CD203c na MTD diminuiu durante o tratamento e retornou aos níveis de pré-tratamento após a interrupção desta terapia. Finalmente, a fitoterapia chinesa FAHF-2 também mostrou um efeito inibitório significativo na resposta do basofil em pacientes com alergia a diferentes alimentos em paralelo com a melhora clínica.
Junto, estes estudos ilustram que a MTD pode ser repetida nos mesmos pacientes ao longo do tempo para avaliar as mudanças na resposta imunológica aos alérgenos alimentares com algum tipo de intervenção, seja imunoterapia oral, imunoterapia sublingual, omalizumabe, ou outras estratégias terapêuticas ou preventivas imunomoduladoras.
Perspectivas futuras
Com a visão de aplicar a MTD ao diagnóstico de alergia alimentar na prática clínica, são necessárias mais pesquisas para definir e validar os cortes de diagnóstico para alergénios específicos e em diferentes populações de doentes. A padronização dos procedimentos laboratoriais seria importante para permitir a comparabilidade dos resultados das MTD entre centros. Isso exigiria a padronização do protocolo para o ensaio in vitro e dos métodos de citometria de fluxo e análise de dados. O uso de metodologia semelhante para as MTD permitiria comparar os resultados das MTD em diferentes centros, tanto para fins clínicos como de pesquisa, inclusive em estudos multicêntricos.
Após adequadamente validadas para o diagnóstico de alergias alimentares específicas, as MTD podem ser usadas para monitorar a resposta clínica a tratamentos imunomoduladores, como imunoterapia e biológicos específicos de alergênios. A MTD também tem um enorme potencial para estudos mecanicistas para melhorar a nossa compreensão do papel dos basófilos nos mecanismos imunitários das alergias alimentares e da tolerância alimentar.