- Abstract
- 1. Introdução
- 2. Materiais e Métodos
- 2,1. Temas
- 2,2. Amostra de sangue
- 2,3. Extracção de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs)
- 2,4. Extração de RNA e Síntese de cDNA
- 2.5. Primer Design
- 2,6. Avaliação dos Fatores Bioquímicos do Soro
- 2,7. Análise e Interpretação dos Resultados
- 3. Resultado
- 3.1. Resultados de qRT-PCR
- 3.2. Avaliação da Expressão dos Genes em PBMC
- 4. discussão
- Conflito de interesses
- Conhecimento
Abstract
ABCA1 e genes ABCG1 codificam as proteínas transportadoras de colesterol que desempenham um papel fundamental na homeostase do colesterol e dos fosfolípidos. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar a expressão dos genes ABCA1 e ABCG1 em pacientes com síndrome metabólica e indivíduos saudáveis. Este estudo de caso-controle foi realizado em 36 pacientes com síndrome metabólica e o mesmo número de indivíduos saudáveis em Hamadan (oeste do Irã) durante 2013-2014. O RNA total foi extraído de células mononucleares e purificado usando a coluna RNeasy Mini Kit. A expressão dos genes ABCA1 e ABCG1 foi realizada pelo qRT-PCR. O perfil lipídico e a glicemia em jejum foram medidos por meio de procedimentos colorimétricos. A expressão do ABCG1 em pacientes com síndrome metabólica foi significativamente menor (cerca de 75%) em comparação com a do grupo controle, enquanto para a expressão do ABCA1 não houve diferença significativa entre os dois grupos estudados. A comparação de outros parâmetros, como HDL-C, FBS, IMC, circunferência da cintura e pressão arterial sistólica e diastólica entre pacientes com síndrome metabólica e indivíduos saudáveis mostrou diferenças significativas (). A diminuição da expressão do ABCG1 em pacientes com síndrome metabólica em comparação a indivíduos saudáveis sugere que hiperglicemia, metabólitos relacionados e hiperlipidemia sobre a capacidade do transportador resultaram em diminuição da expressão do ABCG1. A ausência de uma mudança significativa na expressão do gene ABCA1 entre dois grupos pode indicar um mecanismo de regulação diferente para a expressão do ABCA1.
1. Introdução
A síndrome metabólica (SM) é definida como um conjunto de fatores de risco inter-relacionados de diabetes e doenças cardiovasculares (DCV) . Há alguns critérios para o diagnóstico clínico da síndrome metabólica que incluem circunferência elevada da cintura (≥102 cm nos homens e ≥88 cm nas mulheres), triglicérides elevados (≥150 mg/dL ou 1.7 mmol/L), colesterol lipoproteico de alta densidade reduzido (HDL-C <40 mg/dL ou 1,03 mmol/L em homens e <50 mg/dL ou 1,3 mmol/L em mulheres), e pressão arterial elevada (≥130 mm Hg pressão arterial sistólica ou ≥85 mmHg pressão arterial diastólica) . A SM pode ser diagnosticada através da observação de três destes critérios. Nos últimos anos, a prevalência da SM aumentou em todo o mundo; contudo, nos Estados Unidos da América, diminuiu de 25,5% em 1999/2000 para 22,9% em 2009/2010 . Weiss e colegas relataram que a obesidade está diretamente associada ao aumento da prevalência de SM . Existe uma associação inversa entre a DCV e o nível plasmático de HDL-C, um dos critérios da síndrome metabólica . A lipoproteína de alta densidade, uma subfração das lipoproteínas circulatórias, tem um papel importante no transporte do colesterol do tecido periférico para as células hepáticas . O HDL é rico em proteínas Apo A-I e Apo A-II, e mais de dois terços do seu conteúdo é Apo A-I .
Os transportadores de transmembranas ABC têm um papel importante na absorção do colesterol do macrófago para o HDL e diminuem a formação de células de espuma . ABCA1 composto de 2261 aminoácidos presentes na maioria dos tecidos. Nos últimos anos, tem sido demonstrado que o ABCA1 desempenha um papel essencial na proteção contra doenças cardiovasculares . A síntese de HDL depende diretamente da atividade do ABCA1 nas células hepáticas; em outras palavras, tem uma função chave na proteção das células arteriais contra as células espumosas através do aumento do HDL plasmático. Macrófagos arteriais A atividade da ABCA1 tem mostrado uma associação inversa com a formação de células espumosas, pois com o aumento de sua atividade a formação de células espumosas irá reduzir .
A atividade reduzida ou prejudicada da ABCA1 pode causar algumas doenças como diabetes tipo 2, doença de Tânger e DCV prematura .
O gene ABCG1 está localizado no cromossomo 21q22.3 . Tanto o ABCA1 como o ABCG1 levam à redução do colesterol dos tecidos por seu efluxo para HDL, mas o ABCG1 transporta o colesterol dos tecidos para HDL2 e HDL3 e o ABCA1 transporta-o para Apo A-I livre de lipídios. Os macrófagos são o tecido mais importante da ação do ABCA1 e do ABCG1 . Em muitos estudos, os efeitos da upregulação e da desregulação destes genes foram examinados.
Efluxo de colesterol reduzido é a consequência da falta de expressão do ABCA1 in vitro ; pode levar ao aumento da aterosclerose , mas a upregulação do ABCA1 resulta na redução da aterosclerose . A downregulation do ABCG1 também tem os mesmos efeitos no efluxo de colesterol, mas há resultados controversos sobre o impacto da downregulation do ABCG1 na aterosclerose .
Em MetS, os padrões de expressão de alguns genes mudam e podem levar à obesidade, diabetes e hipertensão. No presente estudo, objetivamos avaliar a expressão dos genes ABCA1 e ABCG1 em pacientes com SM, já que estes genes estão envolvidos na síntese dos transportadores que têm um papel crucial no transporte do colesterol.
2. Materiais e Métodos
2,1. Temas
Este estudo de caso-controle foi realizado em pacientes que foram encaminhados para uma ala de endocrinologia em um hospital em Hamadan (oeste do Irã) durante 2013-2014. Trinta e seis pacientes com síndrome metabólica foram selecionados. Também foram selecionados 36 indivíduos saudáveis com idade e sexo combinados como grupo controle. Nenhum dos indivíduos saudáveis tinha o critério de síndrome metabólica.
O critério de inclusão no grupo de síndrome metabólica foi ter três das cinco características acima mencionadas. Os pacientes com histórico de consumo de antilipídios, contraceptivos e diuréticos foram excluídos do estudo. As pacientes grávidas e pacientes com diabetes, inflamação e infecção também foram excluídas.
2,2. Amostra de sangue
A amostra de sangue de 2,5 mL de cada sujeito foi adicionada a um tubo contendo EDTA e foi mantida a 4°C para extração de RNA (no máximo duas horas depois).
2,3. Extracção de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs)
Soluções de linfodex (Alemanha) e Henx (Irão) foram utilizadas para isolamento de PBMC. Cerca de 2 mL de solução de Henx foram adicionados ao mesmo volume de sangue e misturados completamente; em seguida, ele foi derramado sobre 3 mL de solução linfodex cuidadosamente e lentamente. Em seguida, a mistura foi colocada sobre o linfodex e centrifugada a 1000 g durante 20 minutos. A camada branca intermediária entre o plasma e o linfodex foi isolada como células mononucleares (MCs); em seguida, o tampão Henx foi adicionado ao MC, misturado completamente, e centrifugado. Finalmente, o sobrenadante foi descartado e o processo foi repetido mais uma vez.
2,4. Extração de RNA e Síntese de cDNA
A extração líquida de RNA foi realizada utilizando o kit de purificação de RNA Gene JET de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade e quantidade do RNA purificado foram analisadas usando NanoSpectrofotômetro (Epoch, BioTek, EUA); então a integridade de cada amostra de RNA foi examinada usando 1% de gel de agarose, 1x TBE.
O RNA foi convertido para cDNA usando o Kit de Síntese de cDNA RevertAid First Strand (K1622) seguindo o protocolo: passo 1: recozimento primário a 25°C por 5 min; passo 2: síntese de cDNA a 42°C por 60 min; passo 3: inativação de calor a 70°C por 5 min. Os produtos foram armazenados a -80°C para os próximos passos.
2.5. Primer Design
Os primers específicos para cada gene foram desenhados pelo software Allele ID (versão 7.6). A fim de aumentar a especificidade da reacção PCR em tempo real e reduzir os resultados falsos positivos, um de cada par de primers foi concebido para ser ligado à área de junção Exon-Exon. Os critérios completos dos primers utilizados para cada gene são apresentados na Tabela 1. O gene 18S rRNA foi usado como um controle interno.
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A expressão relativa dos genes foi calculada através da medição do valor do ciclo limiar (CT) para cada amostra usando o termociclador C1000 e o sistema em tempo real CFX96 (Bio-Rad, EUA) e o Kit SYBR Premix Ex Taq 2 (TakaRa No. RR820L). A média da TC em ensaio triplicado de cada amostra foi determinada como valor da TC. As quantidades de ingredientes da reação qRT-PCR incluíram 10 μL verde SYBR, 7 μL água deionizada, e 1 μL de cada um dos primers forward, reverse primer, e template. A qRT-PCR foi realizada nestas condições: ativação inicial a 95°C por 30 seg. e depois se repetiram 40 ciclos dos seguintes passos: desnaturação a 95°C por 5 seg., recozimento à temperatura otimizada de recozimento para duração adequada de cada gene, e extensão a 72°C por 30 seg. e no final, os dados foram adquiridos aumentando a temperatura de 72°C para 95°C por 0,5°C/0,05 seg. Então, os produtos PCR foram eletroforados (em gel de agarose a 1%, 1x TBE) para verificar a especificidade dos amplicons.
2,6. Avaliação dos Fatores Bioquímicos do Soro
Uma amostra de sangue de dois mililitros foi colhida de cada sujeito e centrifugada a 3000 rpm durante 10 min para a separação do soro. Colesterol total (TC), colesterol LDL, TG, FBS e HDL-C foram examinados usando o kit Pars Azmun (Irã) pela Hitachi 911 (Alemanha).
2,7. Análise e Interpretação dos Resultados
fórmula foi usada para a análise da expressão gênica relativa da síndrome metabólica e grupos controle. A eficiência da PCR em tempo real foi calculada para cada gene usando diluição de 10-2; posteriormente, o número obtido foi colocado na seguinte fórmula computacional para medir as alterações da dobra da expressão gênica: o software SPSS V.16 foi usado para análise estatística com intervalos de confiança de 95%. A distribuição normal das variáveis foi verificada pelo método de Kolmogorov-Smirnov e depois os valores foram comparados entre dois grupos através de amostras independentes – teste.
3. Resultado
Características demográficas e fatores bioquímicos dos grupos estudados são apresentados na Tabela 2. A relação macho/fêmea foi de 1/3 em cada grupo (12 M e 24 F). Como mostrado na Tabela 2, as diferenças em todos os parâmetros examinados foram estatisticamente significativas entre dois grupos (), com exceção da idade e do LDL-C. O grupo com síndrome metabólica apresentou IMC, LDL-C, TC, TG, FBS, pressão arterial diastólica/diastólica e cintura circunferencial mais elevadas em relação aos indivíduos saudáveis, enquanto o HDL-C foi significativamente menor na síndrome metabólica.
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BMI: Índice de Massa Corporal; FBS: glicemia rápida; TG: triglicérido, HDL-C: colesterol lipoproteico de alta densidade; LDL-C: colesterol lipoproteico de baixa densidade; diferença significativa. |
3.1. Resultados de qRT-PCR
Após a conclusão da reação PCR, os resultados foram verificados pela análise da curva de reação, curva de fusão dos produtos, e eletroforese dos produtos PCR. A eletroforese foi realizada em agarose a 1% utilizando uma escada de ADN de 100 bp. Os resultados são mostrados na Figura 1.
3.2. Avaliação da Expressão dos Genes em PBMC
Os níveis de expressão dos genes foram medidos nas células mononucleares do sangue periférico e comparados entre dois grupos através do cálculo de ΔCT para cada gene. Não houve diferença na expressão da ABCA1 entre dois grupos, mas a expressão ABCG1 foi significativamente menor no grupo MetS (). Os resultados detalhados são mostrados na Tabela 3.
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Significativo. |
Também, o cálculo da mudança de dobra na expressão ABCG1 () indicou uma expressão 3,1 vezes inferior no grupo MetS.
4. discussão
ABCA1 e ABCG1 têm um papel crucial no transporte reverso do colesterol dos tecidos periféricos, como os macrófagos para o fígado. Entretanto, a expressão dos genes ABCA1 e ABCG1 tem sido estudada em algumas doenças; não encontramos nenhum relatório sobre este assunto na síndrome metabólica. Neste estudo, examinamos a expressão destes genes em sujeitos com síndrome metabólica e indivíduos saudáveis.
Embora não tenha havido diferença significativa na expressão do gene ABCA1 entre dois grupos estudados, encontramos expressão significativamente menor (cerca de 75%) de ABCG1 em sujeitos com síndrome metabólica em comparação ao grupo controle. Singaraja et al. mostraram que a redução do ABCA1 em macrófagos e rins está associada ao aumento do teor de colesterol . Concluíram que a exportação de colesterol mediada pelo ABCA1 poderia contribuir para o aumento da aterosclerose e da nefropatia associada à diabetes . Há alguns relatórios que tentam abordar os possíveis mecanismos que regulam a expressão desses genes. Recentemente, foi demonstrado que os polimorfismos na ABCA1 e ABCC8 podem estar associados à síndrome metabólica. Há evidências mostrando que a interrupção na função ABCA1, que pode ser o resultado de mutação neste gene, pode levar a hipoalipoproteinemia familiar que é caracterizada por baixo HDL e aumento da deposição de ésteres colesterílicos em vários tecidos e células . Também foi demonstrado que a superexpressão do gene ABCA1 pode conferir proteção contra a aterosclerose. Estes dados são consistentes com nossos achados e apoiam esta idéia de que uma menor expressão do gene ABCA1 pode contribuir para complicações da síndrome metabólica.
Haghpassand et al. demonstraram que a expressão do gene ABCA1 nos PBMCs tem relação direta com a carga de colesterol, e a superexpressão do ABCA1 leva à transferência do excesso de colesterol para as apoproteínas . Wang et al. estudaram o transporte reverso do colesterol em camundongos com ABCA1 e ABCG1 e concluíram que quando ambos ABCA1 e ABCG1 foram derrubados, há maior transporte reverso de colesterol comparado ao ABCG1 derrubado .
Since Mauerer et al. apontaram que o alto nível de glicose (hiperglicemia) está envolvido na redução da expressão de ABCA1 e ABCG1 in vitro , parece lógico esperar mudanças similares no MetS. Os promotores de ABCA1 e ABCG1 têm local receptor para LXR e RXR; quando o colesterol oxicólico e o ácido retinóico se unem a estes factores, a expressão de ABCA1 e ABCG1 é aumentada. Além disso, cAMP e NFκB são fatores transcripcionais para ABCA1 e ABCG1, respectivamente.
Os resultados obtidos indicaram uma diminuição significativa na expressão do ABCG1 em pacientes com síndrome metabólica em comparação com indivíduos saudáveis. Esses resultados sugerem que hiperglicemia, metabólitos relacionados e hiperlipidemia sobre a capacidade do transportador podem levar à diminuição da expressão do ABCG1. Como não foi observada alteração significativa na expressão do gene ABCA1, isso pode ser devido a um mecanismo de regulação diferente. Como as estruturas desses genes são diferentes e são reguladas por diversos fatores transcripcionais, nossos resultados podem ser justificados. Entretanto, o número limitado de amostras neste estudo é outro fator para a ausência de alterações na expressão da ABCA1.
O outro ponto é que examinamos a expressão destes genes em PBMC dos sujeitos estudados; é importante notar que as alterações na expressão destes genes em monócitos podem ser diferentes das dos outros tecidos chave como fígado e intestino, que são os principais locais de síntese do HDL. Além disso, as mudanças nos níveis de mRNA não implicam necessariamente mudanças na proteína relacionada.
Conflito de interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses.
Conhecimento
Este trabalho é extraído da tese de mestrado de Zahra Tavoosi. Os autores gostariam de agradecer à Universidade Hamadan de Ciências Médicas por apoiar financeiramente este estudo.