U.S. Food and Drug Administration

Julho 2000

Princípios toxicológicos para a avaliação da segurança dos ingredientes alimentaresRedbook 2000Capítulo IV.C.1.d. Teste de Micronúcleo de Eritrócitos de Mamíferos

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I. Introdução

Micronuclei são corpos citoplasmáticos contendo cromatina formados quando fragmentos de cromossomos ou cromossomos se atrasam durante a anáfase e não são incorporados aos núcleos celulares filhas durante a divisão celular. Como os danos genéticos que resultam em quebras cromossômicas, cromossomos estruturalmente anormais ou anormalidades do fuso levam à formação de micronúcleos, a incidência de micronúcleos serve como um índice desses tipos de danos. Foi estabelecido que essencialmente todos os agentes que causam quebras cromossômicas de cadeia dupla (clastogênios) induzem micronúcleos. Como a contagem de micronúcleos é muito mais rápida e tecnicamente menos exigente do que a contagem de aberrações cromossômicas, e como os micronúcleos surgem de dois tipos importantes de danos genéticos (clastogênese e ruptura do fuso), o ensaio de micronúcleos tem sido amplamente utilizado para triagem de produtos químicos que causam esses tipos de danos.

Este guia aborda o ensaio de micronúcleos mais amplamente utilizado in vivo: o ensaio de micronúcleos eritrócitos de mamíferos. Este ensaio in vivo de micronúcleo é usado para a detecção de danos induzidos pela substância em estudo aos cromossomos ou ao aparelho mitótico dos eritrócitos, através da análise dos eritrócitos, conforme amostrados na medula óssea e/ou células do sangue periférico de animais, geralmente roedores.

O objetivo do teste do micronúcleo é identificar substâncias que causam danos citogenéticos que resultam na formação de micronúcleos contendo fragmentos cromossômicos retardatários ou cromossomos inteiros.

Quando um eritroblasto de medula óssea se desenvolve em um eritrócito policromático, o núcleo principal é extrudado; micronúcleos que foram formados podem ficar para trás no citoplasma, que de outra forma seria enucleado. A visualização dos micronúcleos é facilitada nestas células usando técnicas de coloração específicas e por falta de um núcleo principal. Um aumento na frequência de eritrócitos policromáticos micronucleares em animais tratados é uma indicação de danos cromossômicos induzidos.

II. Definições

Centrômero (Kinetochore) é uma região(ões) de um cromossomo com a qual as fibras do fuso estão associadas durante a divisão celular, permitindo o movimento ordenado dos cromossomos filhas aos pólos das células filhas.

Micronúcleos são pequenos núcleos, separados e adicionais aos núcleos principais das células, produzidos durante a telophase da mitose (meiose) por fragmentos cromossômicos retardados ou cromossomos inteiros.

Eritrócito Normocromático é um eritrócito maduro que carece de ribossomos e pode ser distinguido de eritrócitos imaturos, policromáticos, por manchas seletivas para ribossomos.

É eritrócito policromático é um eritrócito imaturo, em estágio intermediário de desenvolvimento, que ainda contém ribossomos e portanto pode ser distinguido dos eritrócitos maduros, normocromáticos, por corantes seletivos para ribossomos.

III. Considerações iniciais

A medula óssea dos roedores é rotineiramente utilizada neste teste, já que os eritrócitos policromáticos são produzidos naquele tecido. A medida de eritrócitos micronucleares imaturos (policromáticos) no sangue periférico é igualmente aceitável em qualquer espécie na qual a incapacidade do baço de remover eritrócitos micronucleares tenha sido demonstrada, ou que tenha demonstrado uma sensibilidade adequada para detectar agentes que causam aberrações cromossômicas estruturais e/ou numéricas. Os micronúcleos podem ser distinguidos por uma série de critérios. Estes incluem a identificação da presença ou ausência de um cinecoro ou DNA centromérico nos micronúcleos. A frequência de eritrócitos micronucleares imaturos (policromáticos) é o principal ponto final. O número de eritrócitos maduros (normocromáticos) no sangue periférico que contém micronúcleos entre um dado número de eritrócitos maduros também pode ser usado como ponto final do ensaio quando os animais são tratados continuamente durante um período que excede a vida útil do eritrócito na espécie em consideração (por exemplo, 4 semanas no rato), desde que não ocorra uma selecção esplénica significativa contra eritrócitos micronucleados nessa espécie/estirpe. As conseqüências da seleção esplênica, caso ocorra, devem ser totalmente abordadas.

Este teste de micronúcleo in vivo de mamífero é especialmente relevante para avaliar o risco mutagênico, pois permite considerar fatores de metabolismo in vivo, farmacocinética e processos de reparo de DNA, embora estes possam variar entre espécies, entre tecidos e entre desfechos genéticos. Um ensaio in vivo também é útil para investigação adicional de um efeito mutagênico detectado por um sistema in vitro.

Se houver evidência de que a substância em estudo, ou um metabólito reativo, não alcançará o tecido alvo, não é apropriado utilizar este teste.

IV. Princípio do Método do Teste

Animais são expostos à substância em estudo por uma via apropriada. Se for utilizada medula óssea, os animais são sacrificados em momentos apropriados após o tratamento, a medula óssea extraída e as preparações feitas e coradas.(16),(17),(18),(26),(32),(41) Quando o sangue periférico é usado, o sangue é coletado em momentos apropriados após o tratamento e preparações de esfregaço são feitas e coradas.(4),(5),(14),(16),(27),(28),(29),(32) As preparações são analisadas para a presença de micronúcleos.

V. Descrição do Método

A. Preparações

1. Seleção de Espécies Animais

Histórico, ratos ou ratos têm sido usados rotineiramente para este ensaio. Se a medula óssea for o tecido amostrado, qualquer espécie de mamífero apropriada pode ser utilizada (ver secção III., acima). Como em qualquer estudo toxicológico, a selecção das espécies apropriadas deve ser justificada. Quando se utiliza sangue periférico, recomenda-se o uso de ratos. Contudo, qualquer espécie apropriada de mamífero pode ser usada desde que seja uma espécie em que o baço não remova eritrócitos micronucleados ou uma espécie que tenha demonstrado uma sensibilidade adequada para detectar agentes que causam aberrações cromossómicas estruturais e/ou numéricas. Devem ser utilizadas estirpes de laboratório de animais jovens e saudáveis, comumente usadas. No início do estudo, a variação de peso dos animais deve ser mínima e não exceder ±20% do peso médio de cada sexo.

2. Condições de alojamento e alimentação

A temperatura na sala do animal experimental deve ser apropriada para as espécies utilizadas; para ratos e ratos deve ser de 22°C (±3°C). Embora a umidade relativa do ar deve ser de pelo menos 30% e de preferência não deve exceder 70% a não ser durante a limpeza da sala, o objetivo deve ser de 50-60%. A iluminação deve ser artificial, sendo a sequência de 12 horas de luz, 12 horas de escuridão. Para a alimentação, as dietas convencionais de laboratório podem ser usadas com um fornecimento ilimitado de água potável. A escolha da dieta pode ser influenciada pela necessidade de assegurar uma mistura adequada de uma substância em teste quando administrada por esta via. Os animais podem ser alojados individualmente, ou enjaulados em pequenos grupos do mesmo sexo.

3. Preparação dos Animais

Os animais adultos jovens e saudáveis devem ser aleatoriamente atribuídos aos grupos de controle e tratamento. Os animais devem ser identificados de forma única. Os animais devem ser aclimatados às condições laboratoriais por pelo menos cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de tal forma que os possíveis efeitos devidos à colocação de gaiolas sejam minimizados.

4. Preparação das Doses

As substâncias sólidas para teste devem ser dissolvidas ou suspensas em solventes ou veículos apropriados e diluídas, se apropriado, antes da dosagem dos animais. As substâncias de teste líquidas podem ser dosadas diretamente ou diluídas antes da dosagem. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem a aceitabilidade do armazenamento.

B. Condições do teste

1. Solvente/veículo

O solvente/veículo não deve produzir efeitos tóxicos nos níveis de dose utilizados, e não deve ser suspeito de reacção química com a substância em estudo. Se forem utilizados outros solventes/veículos que não os normalmente utilizados, a sua utilização deve ser suportada com dados de referência que indiquem a sua compatibilidade com a substância em estudo e com os animais. Recomenda-se que, quando apropriado, o uso de um solvente/veículo aquoso seja considerado primeiro.

2. Controles

Controles atuais positivos e negativos (solvente/veículo) geralmente devem ser incluídos para cada sexo em cada teste realizado com roedores. No entanto, quando o ensaio micronúcleo é conduzido como parte de um estudo de toxicidade geral de acordo com as orientações GLP, então a verificação da dosagem apropriada será realizada por análise química. Nesses casos, o tratamento simultâneo de animais com um agente de controle positivo pode não ser necessário e o controle dos procedimentos de coloração e pontuação pode ser realizado pela inclusão de amostras de referência apropriadas obtidas anteriormente de animais que não fazem parte do experimento atual. Em estudos com espécies superiores, tais como primatas ou cães, os controles positivos podem ser omitidos desde que uma resposta aceitável às substâncias de controle positivo das espécies utilizadas tenha sido demonstrada previamente pelo laboratório de testes. Em todos os casos, os controles negativos simultâneos são um componente obrigatório do estudo. Com exceção do tratamento com a substância em teste, os animais dos grupos de controle devem ser manuseados de maneira idêntica aos animais dos grupos de tratamento.

Os controles positivos devem produzir micronúcleos in vivo em níveis de exposição que se espera que dêem um aumento detectável e estatisticamente significativo sobre o fundo. As doses de controle positivas devem ser escolhidas de forma que os efeitos sejam claros, mas não revelem imediatamente a identidade das lâminas codificadas para o leitor. É aceitável que o controle positivo seja administrado por uma via diferente da substância em estudo e amostrado em apenas uma única vez. Além disso, o uso de produtos químicos de controle positivo relacionados à classe química pode ser considerado, quando disponível. Exemplos de substâncias de controle positivo incluem:

Negativos animais de controlo, tratados apenas com solvente ou veículo e tratados da mesma forma que os grupos de tratamento, devem ser incluídos para cada amostragem, exceto que em circunstâncias apropriadas pode ser possível usar um animal como seu próprio controle, comparando amostras de pré-tratamento e pós-tratamento. Se for aplicada uma única amostragem para controlos negativos, o tempo de amostragem escolhido deve ser justificado. Além disso, os controles não tratados também devem ser usados a menos que haja (a) dados disponíveis do laboratório de teste, ou (b) dados históricos ou publicados de controle demonstrando que nenhum efeito deletério ou mutagênico é induzido pelo solvente/veículo escolhido.

Se for usado sangue periférico, uma amostra de pré-tratamento também pode ser aceitável como controle negativo simultâneo, mas apenas nos estudos com sangue periférico curto (por exemplo 1-3 tratamento(s)) quando os dados resultantes estiverem na faixa esperada para o controle histórico e quando a ausência de efeito solvente tiver sido demonstrada.

VI. Procedimento para Ratos e Ratos

As seções seguintes fornecem orientações para procedimentos em ratos e ratos, as espécies mais usadas neste ensaio.

A. Número e sexo dos animais

Cada grupo tratado e controle deve incluir pelo menos 5 animais analisáveis por sexo.(12) Se no momento do estudo houver dados disponíveis de estudos na mesma espécie e usando a mesma via de exposição que demonstrem que não há diferenças substanciais entre os sexos em toxicidade, então os testes em um único sexo serão suficientes.

B. Horário de tratamento

Several diferentes horários de tratamento (ou seja, 1, 2, ou mais tratamentos em intervalos de 24 horas) podem ser recomendados. Amostras de regimes de dose prolongada são aceitáveis desde que tenha sido demonstrado um efeito positivo para este estudo ou, para um estudo negativo, desde que tenha sido demonstrada toxicidade ou que tenha sido utilizada a dose limite (ver secção “D”, abaixo), e a dosagem continuou até ao momento da amostragem. Isto é baseado em estudos que mostram que exposições repetidas de ratos e ratos até a duração subcrônica produziram efeitos de magnitude similar aos obtidos com o ensaio agudo tradicional.(1),(2),(8),(11),(19),(21),(22),(23),(25),(29),(37),(38),(44),(48),(50) No entanto, como há alguma preocupação de que a sensibilidade possa ser reduzida em estudos a longo prazo devido a uma falha na obtenção de uma DTM verdadeira, ou porque a adaptação pode ocorrer, atualmente considera-se que a duração do tratamento deve ser limitada a quatro semanas até que a sensibilidade do ensaio seja confirmada quando tratamentos mais longos forem utilizados.(12)

As substâncias de teste também podem ser administradas como uma dose dividida, ou seja dois ou mais tratamentos no mesmo dia separados por não mais de algumas horas, para facilitar a administração de um grande volume de material ou para minimizar as flutuações nos níveis sanguíneos do produto em estudo.

Duas formas de realizar o teste são:

• Animais são tratados com a substância em estudo uma ou duas vezes com um intervalo de não mais de 24 horas. As amostras de medula óssea são colhidas pelo menos duas vezes entre 24 e 48 horas após a última dose, com intervalo(s) apropriado(s) entre as amostras. O uso de amostras antes de 24 horas após o tratamento deve ser justificado. As amostras de sangue periférico são colhidas pelo menos duas vezes entre 36 e 72 horas após o último tratamento, com intervalo(s) apropriado(s) entre as amostras. Quando uma resposta positiva é reconhecida em uma única amostragem, não é necessária uma amostragem adicional.
• Se forem utilizados três ou mais tratamentos diários (por exemplo, três ou mais tratamentos com intervalos de 24 horas), as amostras podem ser colhidas uma vez no máximo 24 horas após o tratamento final para a medula óssea e uma vez no máximo 40 horas após o tratamento final para o sangue periférico.(12), (20)

Tempos de amostragem adicionais podem ser utilizados, quando relevante e cientificamente justificado.

C. Níveis de dose

Se um estudo de achado de faixa de dose for realizado por não haver dados adequados disponíveis, ele deve ser realizado no mesmo laboratório, usando a mesma espécie, cepa, sexo e regime de tratamento a ser usado no estudo principal.(7) Se houver toxicidade, três níveis de dose devem ser usados para o primeiro tempo de amostragem. Estes níveis de dose devem cobrir uma faixa de toxicidade clara a pouca ou nenhuma toxicidade. No último momento da amostragem, apenas a dose mais alta precisa ser utilizada. A dose mais alta é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que níveis de dose mais elevados, com base no mesmo regime de dosagem, seriam esperados para produzir letalidade. Substâncias com actividades biológicas específicas em doses baixas não tóxicas (tais como hormonas e mitógenos) podem ser excepções aos critérios de determinação da dose e devem ser avaliadas caso a caso. A dose mais elevada também pode ser definida como uma dose que produz alguma indicação de toxicidade da medula óssea (por exemplo, uma redução na proporção de eritrócitos imaturos entre os eritrócitos totais da medula óssea ou sangue periférico).

D. Teste Limite

Se nenhum efeito tóxico observável resultar de um único tratamento com uma dose de pelo menos 2000 mg/kg de peso corporal, ou de dois tratamentos no mesmo dia, e se a genotoxicidade não for esperada com base em dados de substâncias estruturalmente relacionadas, então um estudo completo usando 3 níveis de dose pode não ser necessário. Para estudos de maior duração, a dose limite é de 2000 mg/kg/peso corporal/dia para tratamentos até 14 dias, e 1000 mg/kg/peso corporal/dia para tratamentos superiores a 14 dias. A exposição humana esperada pode indicar a necessidade de uma dose mais elevada a ser utilizada no teste limite.

E. Administração de Doses

A substância em teste é geralmente administrada por gavagem usando um tubo estomacal ou uma cânula de intubação adequada, ou por injeção intraperitoneal. Outras vias de exposição podem ser aceitáveis onde possam ser justificadas. O volume máximo de líquido que pode ser administrado por gavagem ou injeção de uma vez depende do tamanho do animal de teste. O volume não deve exceder 2 ml/100g de peso corporal. A utilização de volumes superiores a estes deve ser justificada. Com exceção de substâncias irritantes ou corrosivas, que normalmente revelarão efeitos exacerbados com concentrações mais altas, a variabilidade no volume do teste deve ser minimizada ajustando a concentração para garantir um volume constante em todos os níveis de dose.

F. Preparação da medula óssea/lood Preparação

Células da medula óssea são geralmente obtidas dos fêmures ou tíbias imediatamente após o sacrifício. Geralmente, as células são retiradas dos fêmures ou tíbias, preparadas e coradas usando métodos estabelecidos. O sangue periférico é obtido a partir da veia caudal ou outro vaso sanguíneo apropriado. As células sanguíneas são imediatamente coradas supravitalmente(4),(5),(14) ou preparações de esfregaço são feitas e então coradas. O uso de uma coloração específica de DNA (por exemplo, acridina laranja(15) ou Hoechst 33258 mais pyronin-Y(30)) pode eliminar alguns dos artefatos associados ao uso de uma coloração não específica de DNA. Esta vantagem não impede o uso de corantes convencionais (por exemplo, Giemsa). Sistemas adicionais (p.ex, colunas de celulose para remover células nucleadas(36)) também podem ser usadas desde que estes sistemas tenham demonstrado funcionar adequadamente para a preparação de micronúcleos em laboratório.

G. Análise

A proporção de eritrócitos imaturos entre os eritrócitos totais (imaturos + maduros) é determinada para cada animal contando um total de pelo menos 200 eritrócitos para medula óssea e 1000 eritrócitos para sangue periférico.(9) Todas as lâminas, incluindo as de controle positivo e negativo, devem ser codificadas independentemente antes da análise microscópica. Pelo menos 2000 eritrócitos imaturos por animal são pontuados para a incidência de eritrócitos micronucleados imaturos. Informação adicional pode ser obtida através da pontuação de eritrócitos maduros para os micronúcleos. Ao analisar as lâminas, a proporção de eritrócitos imaturos entre os eritrócitos totais não deve ser inferior a 20% do valor de controle. Quando os animais são tratados continuamente durante 4 semanas ou mais, pelo menos 2000 eritrócitos maduros por animal também podem ser pontuados para a incidência de micronúcleos. Sistemas para análise automatizada (análise de imagem ou análise citométrica de fluxo de suspensões celulares) são alternativas aceitáveis à avaliação manual se adequadamente justificadas e validadas em relação à pontuação microscópica clássica.(12)

VII. Procedimento para Espécies que não Ratos e Ratos

Informação publicada com base em estudos em ratos, ratos, hamsters, suínos, cães, primatas não humanos e humanos(3),(6),(18),(28),(31),(32),(39),(40),(45) indicam que as frequências espontâneas e induzidas de eritrócitos micronucleados são semelhantes na maioria das espécies de mamíferos e sugerem que a medida da incidência de eritrócitos imaturos micronucleados na medula óssea é apropriada para avaliar os danos cromossômicos ou do fuso nas espécies estudadas até o momento. O aparecimento e desaparecimento de eritrócitos micronucleados na medula óssea é uma função da cinética da eritrogenese e da duração de vida dos eritrócitos em cada espécie, pelo que os regimes de dosagem e amostragem devem ser modificados de acordo com os parâmetros apropriados da cinética dos eritrócitos para cada espécie. Outras espécies além de ratos ou ratos podem ser utilizadas quando apropriado, mas a seguinte informação deve ser incluída:

• Justificativa das espécies selecionadas, e os horários de dosagem e amostragem utilizados em relação à cinética da eritropoiese e a vida útil dos eritrócitos nas espécies utilizadas;
• Evidência de que a freqüência espontânea dos micronúcleos seja consistente com a informação publicada, e/ou consistente dentro do laboratório que conduz o estudo;
• Avidência de que os genotoxicantes conhecidos produzem um aumento na frequência de micronúcleos nas espécies utilizadas, e valores de referência para a magnitude da resposta induzida;
• Impacto da remoção seletiva esplênica de células micronucleadas do sangue periférico (quando este último serve como o tecido a ser monitorado).

VIII. Dados e Relatórios

A. Resultados do tratamento

Dados individuais dos animais devem ser apresentados em forma de tabela. A unidade experimental é o animal. O número de eritrócitos imaturos pontuados, o número de eritrócitos imaturos micronucleados e o número de eritrócitos imaturos entre os eritrócitos totais devem ser listados separadamente para cada animal analisado. Quando os animais são tratados continuamente durante 4 semanas ou mais, os dados sobre eritrócitos maduros também devem ser dados se forem recolhidos. A proporção de eritrócitos imaturos entre os eritrócitos totais e, se for considerado aplicável, a percentagem de eritrócitos micronucleados maduros deve ser dada para cada animal. Se não houver evidência de uma diferença na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos podem ser combinados para análise estatística.

B. Avaliação e Interpretação dos Resultados

Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, tais como um aumento relacionado à dose no número de células micronucleadas ou um claro aumento no número de células micronucleadas em um grupo de dose única em um único momento de amostragem. Métodos estatísticos devem ser usados para avaliar os resultados dos testes(24),(35) Os critérios estatísticos para um resultado positivo, negativo ou equívoco devem ser claramente indicados no protocolo. Como fatores biológicos podem modificar a interpretação, a significância estatística não deve ser o único fator determinante para se chegar a uma conclusão. Resultados equívocos devem ser esclarecidos por testes adicionais, usando uma modificação das condições experimentais se apropriado.

Embora a maioria dos experimentos dê resultados claramente positivos ou negativos, em casos raros o conjunto de dados impedirá que se faça um julgamento definitivo sobre a atividade da substância em estudo. Os resultados podem permanecer equívocos ou questionáveis independentemente do número de vezes que o experimento for repetido.

Resultados positivos no teste do micronúcleo indicam que uma substância induz micronúcleos, que são o resultado de danos cromossômicos ou danos ao aparelho mitótico nos eritroblastos da espécie em teste. Resultados negativos indicam que, sob as condições do teste, a substância em teste não produz danos cromossômicos ou do fuso, levando à formação de micronúcleos nos eritrócitos imaturos da espécie em teste.

A probabilidade de que a substância em teste ou seus metabólitos atinjam a circulação geral ou especificamente o tecido alvo (por exemplo, toxicidade sistêmica) deve ser discutida. A demonstração de exposição adequada do tecido alvo em um ensaio micronúcleo negativo é uma consideração particularmente importante quando há evidência positiva de genotoxicidade em um ou mais sistemas de teste.

C. Relatório do teste

O relatório do teste também deve incluir as seguintes informações:

1. Substância de teste

• dados de identificação e número CAS, se conhecido
• natureza física e pureza
• propriedades físico-químicas relevantes para a condução do estudo
• estabilidade da substância em estudo, se conhecido

2. Solvente/veículo

• justificação para escolha do veículo
• solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/veículo, se conhecido

3. Soluções de dosagem

• solubilidade e estabilidade da substância em teste na escolha do veículo/veículo, se conhecido

3. Animais testados

• espécie/estirpe utilizada, incluindo justificação
• número, idade e sexo dos animais
• fonte, condições de alojamento, dieta, etc.
• peso individual dos animais no início do teste, incluindo faixa de peso corporal, média e desvio padrão para cada grupo
• informação sobre a potencial influência da seleção esplênica na incidência de células micronucleadas no sangue periférico, se aplicável

5. Condições de teste

• dados de controle positivos e negativos (veículo/solvente)
• dados do estudo de localização da gama, se conduzido
• racionale para seleção do nível de dose
• detalhes da preparação da substância em estudo
• detalhes da administração da substância em estudo
• racionale para via de administração e regime de dosagem
• métodos para verificar se a substância em estudo atingiu a circulação geral e/ou o tecido alvo, se aplicável
• conversão da concentração de substância de teste dieta/água potável (ppm) para a dose real (mg/kg peso corporal/dia), se aplicável
• detalhes da qualidade dos alimentos e da água
• descrição detalhada dos horários de tratamento e amostragem
• métodos de preparação de lâminas
• métodos para medição da toxicidade
• critérios de pontuação de eritrócitos imaturos micronucleados e, se apropriado e aplicável, eritrócitos maduros
• número de células analisadas por animal
• critérios para considerar os estudos como positivos, negativos ou equívocos

6. Resultados

• sinais de toxicidade
• proporção de eritrócitos imaturos entre eritrócitos totais
• número de eritrócitos imaturos micronucleados entre eritrócitos imaturos totais, dado separadamente para cada animal
• se apropriado e aplicável, número de eritrócitos imaturos micronucleados entre eritrócitos imaturos totais, dado separadamente para cada animal
• média ± desvio padrão de eritrócitos micronucleares imaturos e, se aplicável, eritrócitos maduros por grupo
• relação dose-resposta, quando possível
• análises estatísticas e justificação do método aplicado, com citação apropriada na literatura
• dados de controle negativos atuais e históricos
• dados de controle positivos atuais e históricos

7. Discussão dos Resultados

8. Conclusão

XI. Adendo: Identificação de Micronúcleos Derivados de Fragmentos Acêntricos vs. Cromossomos Centroméricos

Micronúcleos podem ser formados por fragmentos acêntricos ou cromossomos inteiros com retardamento na mitose. Estes últimos micronúcleos foram reconhecidos primeiramente pelo seu grande tamanho,(49) pela banda C(47) ou pela medição do conteúdo de DNA.(46) Entretanto, estes métodos não foram muito confiáveis. Portanto, dois métodos citogenéticos moleculares foram desenvolvidos para identificar a presença de centrômeros em micronúcleos e assim diferenciar entre micronúcleos de origem clastogênica e aneugênica:(12) 1) coloração imunofluorescente de CREST e 2) hibridização fluorescente in situ (FISH) com sondas pancentrômicas de DNA. Quando é mecanisticamente importante determinar a presença do cinecentro ou centrômero nos micronúcleos, estes métodos podem ser aplicados.

O método CREST aplicado ao teste do micronúcleo da medula óssea é descrito em detalhes por Miller e Adler.(33) As células das lâminas (esfregaços normais de medula óssea) são fixadas, desidratadas, incubadas em dois passos com SDS e Triton-X, e então coradas com anticorpos. O DNA é contra-manchado por Hoechst 33258.

Com FISH, a sonda de DNA satélite menor que hibridiza próximo ao centrômero(43) é usada para identificar a região centrômica, se presente. Um método para FISH com as sondas de DNA centrômeros foi descrito por Pinkel et al.(34) Este método pode ser aplicado a micronúcleos com eritrócitos classificados em fluxo(10) ou a micronúcleos isolados obtidos de amostras de sangue periférico.(13)

Em lâminas de controle, a taxa de micronúcleos rotulados contendo a região centrromérica é de cerca de 50%(43) Aproximadamente 70% dos micronúcleos induzidos por aneugênios conhecidos (colchicina e vinblastina) são rotulados,(33) enquanto aqueles induzidos por clastógenos (hidroquinona e mitomicina C) apresentam apenas 5-15% de micronúcleos rotulados.(33) Para caracterizar a atividade relativa clastogênica versus aneugênica de um produto químico, é útil utilizar como índice o número de eritrócitos policromáticos micronucleados por 1000 eritrócitos policromáticos que contêm a região centrromérica.(42)

A principal deficiência nos métodos FISH descritos até o momento é que eles não diferenciam entre eritrócitos normocromáticos e eritrócitos policromáticos.(12) Assim, somente preparações nas quais uma grande fração dos micronúcleos presentes é induzida pelo produto em estudo são adequadas para análise. Por exemplo, amostras de sangue periférico de experimentos com exposições agudas em animais adultos nunca são essencialmente adequadas para análise porque a população celular alvo (eritrócitos imaturos) é de apenas 3-5% dos eritrócitos da amostra.

Em conclusão, CREST- ou FISH-labeling são considerados métodos confiáveis para detectar propriedades aneugênicas de produtos químicos no ensaio in vivo de micronúcleo, desde que seja dada atenção para garantir que amostras apropriadas sejam utilizadas para análise.(12) Entretanto, a complexidade dos métodos atuais limita seu uso aos casos em que há suspeita de que um produto químico cause comprometimento do fuso (por exemplo devido à presença de grandes micronúcleos, à indução da poliploidia, etc.) ou quando existem outras razões específicas para obter esta informação mecanicista.

X. Referências

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