Pyrosekvensointi on DNA:n sekvensointimenetelmä (DNA:n nukleotidien järjestyksen määrittäminen), joka perustuu ”sekvensointi synteesin avulla” -periaatteeseen, jossa sekvensointi suoritetaan havaitsemalla DNA-polymeraasin sisällyttämä nukleotidi. Pyrosekvensointi perustuu valon havaitsemiseen, joka perustuu ketjureaktioon, kun pyrofosfaattia vapautuu. Siitä nimi pyrosekvensointi.
Bertil Pettersson, Mathias Uhlen ja Pål Nyren kuvasivat pyrosekvensoinnin periaatteen ensimmäisen kerran vuonna 1993 yhdistämällä kiinteän faasin sekvensointimenetelmän, jossa käytetään streptavidiinillä päällystettyjä magneettihelmiä ja rekombinantti-DNA-polymeraasia, jolta puuttuu 3´-5´eksonukleaasiaktiviteetti (proof-reading), sekä luminesenssin havaitsemisen tulikärpäslukiferaasientsyymiä käyttäen. Sekvensoitavaan yksisäikeiseen DNA:han lisätään kolmen entsyymin (DNA-polymeraasi, ATP-sulfuraasi ja tulikärpäslukiferaasi) ja nukleotidin (dNTP) seos, ja nukleotidin sitoutumista seurataan mittaamalla emittoituvaa valoa. Valon voimakkuus määrittää, onko nukleotideja sisällytetty 0, 1 tai enemmän, mikä osoittaa, kuinka monta komplementaarista nukleotidia templaattisäikeessä on. Nukleotidiseos poistetaan ennen seuraavan nukleotidiseoksen lisäämistä. Tämä prosessi toistetaan jokaisella neljällä nukleotidilla, kunnes yksisäikeisen templaatin DNA-sekvenssi on määritetty.
Toisen liuokseen perustuvan pyrosekvensointimenetelmän kuvasivat Mostafa Ronaghi, Mathias Uhlen ja Pål Nyren vuonna 1998. Tässä vaihtoehtoisessa menetelmässä käytetään lisäksi apyraasi-entsyymiä poistamaan nukleotideja, joita DNA-polymeraasi ei ole sisällyttänyt. Tämä mahdollisti sen, että entsyymiseos, joka sisältää DNA-polymeraasin, luciferaasin ja apyraasin, voitiin lisätä alussa ja säilyttää koko prosessin ajan, mikä mahdollisti yksinkertaisen ja automatisoitavissa olevan asetelman. Pyrosequencing-yritys toi seuraavana vuonna markkinoille tähän periaatteeseen perustuvan automatisoidun laitteen.
Kolmannen mikrofluidisen muunnoksen Pyrosequencing-menetelmästä kuvasi vuonna 2005 Jonathan Rothberg ja työtoverit 454 Life Sciences -yrityksessä. Tämä vaihtoehtoinen lähestymistapa pyrosekvensoinnille perustui alkuperäiseen periaatteeseen, jonka mukaan sekvensoitava DNA kiinnitetään kiinteään alustaan, ja he osoittivat, että sekvensointi voidaan suorittaa erittäin rinnakkaisella tavalla käyttämällä mikrovalmistettua mikrosirua. Tämä mahdollisti suuren läpimenotehon DNA-sekvensoinnin, ja markkinoille tuotiin automatisoitu laite. Siitä tuli ensimmäinen seuraavan sukupolven sekvensointilaite, joka aloitti uuden aikakauden genomitutkimuksessa, kun DNA-sekvensoinnin hinnat laskivat nopeasti ja mahdollistivat koko genomin sekvensoinnin kohtuuhintaan.