Solujen eloonjääminen säteilytyksen jälkeen
Säteilytyksen aikaansaaman solukasvun ja -kuoleman tutkiminen, määriteltynä ajanjaksona, joka tarvitaan proliferaatiokapasiteetin täydelliseen häviämiseen tai proliferaatiokapasiteetin kohoamiseen, on yksi yleisimmin ja luotettavimmin käytetyistä menetelmistä, joilla tutkitaan säteilyn vaikutuksia soluihin. Säteilytyskokeissa laboratoriomme varmisti, että 3-(4,5-dimetyylitatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsolibromidin (MTT) lukemat olivat verrannollisia solujen lukumäärään in vitro, ainakin eksponentiaalisen kasvun vaiheessa (tietoja ei ole esitetty). 12C6+-ionisäteilytys suurella energialla johtaa yleensä siihen, että suurin osa soluista kuolee. Solukuoleman osuus säteilytyksen jälkeisessä viivästysvaiheessa ja kaksinkertaistumisajan muutokset voidaan mitata määrittämällä eri ajankohtina säteilytyksen jälkeen. Koska määrityksessämme ei ollut kyse vain eloonjäämisen määrittämisestä yhdestä pisteestä, myös tietoa kasvun suorituskyvystä voitiin hankkia helposti. Eloonjäämiskäyrä piirrettiin luonnollisella logaritmisella asteikolla eloonjäämisosuudesta suhteessa eri fysikaalisiin parametreihin.
C. tyrobutyricum 25755 -solut säteilytettiin 20 tuntia kylvön jälkeen. Kannat, joilla oli alhaisin metabolinen aktiivisuus ja hitain lisääntyminen tai solut, jotka lakkasivat lisääntymästä, suljettiin pois kokeesta pesemällä ja trypsiinisoimalla, kun levitys tehtiin säteilytyksen jälkeen. Yhtälöstä (1) saatua eloonjäämisosuutta verrattiin edustaviin kokeellisiin tietoihin. Kuvassa 1 esitetään eloonjäämiskäyrien vertailu 12C6+-ionisäteilytyksen jälkeen eri säteilyenergioilla C. tyrobutyricum ATCC 25755:n eri kannoille. MTT-määrityksen tulokset on piirretty säteilytysannoksen (10-50 Gy) suhteen 68 AMeV:n energialla ja 106-108 ionin – pulssi-1 -tasoilla, jotka olivat e0 → e-4,5 kuvassa 1A, e0 → e-5,8 kuvassa 1B ja e0 → 0 kuvassa 1C. Kuvissa 1D-F esitetään solujen selviytymistiedot MTT-määrityksen tuloksista säteilytysannoksen (10-50 Gy) suhteen 114 AMeV:n energialla ja 106-108 ionipulssi-1-tasolla, jotka olivat e0 → 0. Yleisesti ottaen laskelmien ja kokeellisten tietojen välille saatiin riittävä yhteisymmärrys. Yhtälö aliarvioi annoksen tehon 68 AMeV:llä käsitellyille kannoille, kun taas korkeilla energioilla (114 AMeV) säteilytetyille soluille tulos oli yliarvioitu. Suurin poikkeama, joka saatiin laskettujen ja mitattujen annosten suhteesta tietylle vaikutustasolle, oli 15 prosenttia. Kantojen eloonjäämisosuus riippui voimakkaasti 12C6+-ionisäteen erityisistä fysikaalisista ominaisuuksista, jotka määräytyivät tarkasteltavien hiukkasten energian, annoksen ja ionien – pulssi-1 -tasojen perusteella (kuva 1). Selvästikin eloonjäämisosuus pieneni hiiliionien energian kasvaessa. Odotetusti kokeiden eloonjäämislogaritmi osoitti samoja ominaisuuksia: eloonjääminen riippui 12C6+-ionisäteilytyksen energiasta, ionipulssi-1:stä ja annoksesta. Yhden fysikaalisen parametrin kasvattaminen kerrallaan johti eloonjäämisnopeuden pienenemiseen. Hyvin rajallinen eloonjääminen (e-3,5 → e-6,5) saavutettiin, kun 12C6+-ionia säteilytettiin käyttämällä 114 AMeV:n energiaa, 20-40 Gy:n annosta ja 106-108 ionipulssia-1.
12C6+-ionisäteilytyksen vaikutus Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755:n selviytymiseen. Soluja säteilytettiin 20 h kylvön jälkeen ja eloonjäämisen aste määritettiin MTT-määrityksellä. Selviytymistiedot on piirretty säteilytystasojen suhteen. (A-C) 12C6+-ioneja kiihdytettiin 68 AMeV:iin asti, ja niiden ionit/pulssi vaihtelivat 106:sta 108:aan annosnopeudella 10-50 Gy. (D-F) 12C6+-ioneja kiihdytettiin 114 AMeV:iin asti, ja niiden ionit/pulssi vaihtelivat välillä 106-108 annosnopeudella 10-50 Gy. Solut, joilla oli alhainen metabolinen aktiivisuus ja hidas proliferaatio, tai solut, jotka lakkasivat lisääntymästä, suljettiin pois kokeesta pesemällä ja trypsiinisoimalla, kun levitys tehtiin säteilytyksen jälkeen.
Monille solutyypeille on ominaista säännöllinen solunjakautuminen 12-24 tunnin välein. Eksponentiaalisen kasvun voimakkuuden vuoksi yksittäinen solu voi synnyttää tuhansia tyttärisoluja noin yhdeksän- tai kahdentoista normaalin jakautumissyklin eli muutaman päivän aikana. Säteilytyksen jälkeen eloonjääneet voivat sitten koostua joistakin mutanteista. Hyvin pieni osa C. tyrobutyricum ATCC 25755:n eloonjääneistä voi osoittaa parantunutta kykyä tuottaa butyraattia.
Butyraattihapon vaikutukset solujen kasvuun säteilytyksen jälkeen
C. tyrobutyricum ATCC 25755 käyttää hiili- ja energialähteenä glukoosia tai ksyloosia. Monosakkaridi kuljetetaan soluun fosfoenolipyruvaatti-riippuvaisen fosfotransferaasin ottojärjestelmän kautta. Tämän jälkeen glukoosi tai ksyloosi metaboloituu glykolyysin avulla, jonka pH-riippuvuus on merkityksetön pH-alueella pH 7:stä pH 5,5:een. Käyminen kuitenkin pysähtyi, kun solut eivät enää kuluttaneet glukoosia tai ksyloosia, koska butyraatti esti sen. Jotta voitaisiin tutkia tarkemmin säteilytyksen erityistä vaikutusta solujen kasvuprofiileihin (perustuen solususpension optisen tiheyden (OD) mittauksiin 600 nm:ssä), yksittäisiä eräviljelmiä tehtiin kemiallisesti määritellyssä P2-mediumissa (seerumipulloissa), joka sisälsi 42 g-L-1 glukoosia ja jota täydennettiin 3,6, 7,2 ja 10,8 g-L-1 voihapolla. C. tyrobutyricum ATCC 25755 -viljelmän (kuva 2A, kontrolli) pH laski noin 4,8:aan (ΔpH 1,4, pH:sta 6,2) verrattuna siihen, kun sitä täydennettiin 3,6 g-L-1 voihappoa (kuva 2A1), 7. C. tyrobutyricum ATCC 25755 -viljelmän (kuva 2A, kontrolli) pH laski noin 4,8:aan.2 g-L-1 voihappoa (kuva 2A2) ja 10,8 g-L-1 voihappoa (kuva 2A3), vastaavat pH-arvot olivat vastaavasti noin 6,0 (ΔpH 0,5 alkaen 6,5), 6,1 (ΔpH 0,3 alkaen 6,4) ja 5,9 (ΔpH 0,5 alkaen 6,4). Kun viljelmää kuitenkin säteilytettiin 68 AMeV:llä annoksella 40 Gy (kuva 2D, kontrolli), pH laski noin 4,8:aan (ΔpH 1,7 alkaen 6,5:stä), kun taas annoksella 40 Gy (täydennettynä 3,6 g-L-1 voihappoa) (kuva 2D1), annoksella 40 Gy (täydennettynä 7.2 g-L-1 voihappoa) (kuva 2D2) ja annoksella 40 Gy (täydennettynä 10,8 g-L-1 voihapolla) (kuva 2D3) pH-arvot olivat vastaavasti noin 4,6 (ΔpH 1,6 alkaen 6,2), 4,8 (ΔpH 1,4 alkaen 6,2) ja 5,9 (ΔpH 0,3 alkaen 6,2). Kun viljelmää säteilytettiin 114 AMeV:llä ja annoksella 40 Gy (kuva 2G, kontrolli), pH laski noin 5,7:ään (ΔpH 0,6 alkaen 6,3), kun taas annoksella 40 Gy (täydennettynä 3,6 g-L-1 voihappoa) (kuva 2G1), annoksella 40 Gy (täydennettynä 7.2 g-L-1 voihappoa) (kuva 2G2) ja annoksella 40 Gy (täydennettynä 10,8 g-L-1 voihapolla) (kuva 2G3) pH-arvot olivat vastaavasti noin 5,7 (ΔpH 0,6 alkaen 6,3), 5,4 (ΔpH 0,9 alkaen 6,3) ja 5,6 (ΔpH 0,7 alkaen 6,3). Kun viljelmää säteilytettiin 68 AMeV:llä ja annoksella 20 Gy (täydennettynä 7,2 g-L-1 voihapolla) (kuva 2B2), pH laski noin 4,4:ään (ΔpH 0,9 alkaen 6,3), kun taas annoksella 30 Gy (täydennettynä 7.2 g-L-1 voihappoa) (kuva 2C2) ja annoksella 40 Gy (täydennettynä 7,2 g-L-1 voihapolla) (kuva 2D2) pH-arvot olivat vastaavasti noin 4,6 (ΔpH 1,7 alkaen 6,3:sta) ja 4,8 (ΔpH 1,5 alkaen 6,3:sta). Kun viljelmää säteilytettiin 114 AMeV:llä ja annoksella 40 Gy (täydennettynä 10,8 g-L-1 voihapolla) (kuva 2E3), pH-arvo laski 5,9:ään (ΔpH 0,4 alkaen 6,3:sta), kun taas annoksella 30 Gy (täydennettynä 10,8 g-L-1 voihapolla) (kuva 2F3) ja annoksella 40 Gy (täydennettynä 10,8 g-L-1 voihapolla) (kuva 2G3) pH-arvot olivat noin 6. Tämän jälkeen pH-arvo oli noin 5,9 (ΔpH 0,5).0 (ΔpH 0,3 alkaen 6,3) ja 5,8 (ΔpH 0,5 alkaen 6,3).
Wildtyypin ja säteilytettyjen solujen aktiivisuuksien aikakäyrä lisättyjen voihappokonsentraatioiden funktiona fermentoinnin ensimmäisten 54 tunnin aikana. (A) Villikantojen solukasvu, johon butyraatin lisäys ei vaikuttanut (kontrolliviljelmät). (B-D) Säteilytettyjen kantojen solukasvu (energia 68 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy), johon butyraatin lisääminen ei vaikuta (vertailuviljelmät). (E,F) Säteilytettyjen kantojen solukasvu (energia 114 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy), johon butyraatin lisääminen ei vaikuta (kontrolliviljelmät). ( A1-A3) Lisätyn butyraatin vaikutukset villityypin solujen kasvuun. Yksittäiset eräviljelmät suoritettiin kemiallisesti määritellyssä P2-mediumissa (seerumipulloissa), joka sisälsi glukoosia (noin 42 g-L-1) ja johon oli lisätty 3,6 (A1), 7,2 (A2) ja 10,8 g-L-1 (A3) voihappoa. (B1-B3, C1-C3, D1-D3) Lisätyn voihapon vaikutus säteilytettyjen solujen kasvuun (energia 114 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy). Yksittäiset eräviljelmät suoritettiin kemiallisesti määritellyssä P2-mediumissa (seerumipulloissa), joka sisälsi glukoosia (noin 42 g-L-1) ja johon lisättiin 3,6 (X1), 7,2 (X2) ja 10,8 g-L-1 (X3) voihappoa. (E1-E3, F1-F3, G1-G3) Lisätyn voihappobutyraatin vaikutukset säteilytettyjen solujen kasvuun (energia 114 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy). Yksittäiset eräviljelmät suoritettiin kemiallisesti määritellyssä P2-mediumissa (suoritettiin seerumipulloissa), joka sisälsi glukoosia (noin 42 g-L-1) ja jota oli täydennetty 3,6 (X1), 7,2 (X2) ja 10,8 g-L-1 (X3) voihapolla.
Nämä pH-erot säätelevät liuottimen muodostumiseen liittyvää ajallista vaihtumista kussakin säteilytetyllä kannalla. Tämä viittaa siihen, että villityypin ja säteilytetyillä kannoilla oli kaksivaiheinen aineenvaihduntamalli, johon väliaineen pH vaikutti voimakkaasti. Yleisenä suuntauksena voidaan todeta, että solut kuluttivat aluksi glukoosia kasvun tukemiseksi ja tuottivat ja erittivät orgaanisia happoja (butyraattia ja asetaattia) ensisijaisina aineenvaihduntatuotteina (asidogeneesi), mikä aiheutti väliaineen pH:n laskun, kun niitä kertyi tiettyyn tasoon. Tämä liemen happamuuden nousu siirsi happojen muodostumista kohti liuottimien tuotantoa, kun viljelmä saavutti solukasvun stationaarivaiheen (liuotinogeneesi). Korkeassa pH:ssa muodostuu pääasiassa orgaanisia happoja, kun taas matalassa pH:ssa liuottimien tuotanto stimuloituu. Odotetusti metabolisen siirtymän luonne ja liuottimien muodostumisen kineettinen malli riippuivat kannasta, koska säteilytetyillä kannoilla oli omat geneettiset ja metaboliset ominaispiirteensä. Viinihapon on aiemmin raportoitu estävän solujen kasvua . Tulokset osoittivat, että villityypin kannoissa solujen kasvu estyi asteittain, eikä todellista kasvua havaittu yli 3,6 g-L-1 :n voihappopitoisuuksilla. Säteilytetyissä kannoissa solukasvun asteittaista estymistä ei kuitenkaan tapahtunut, eikä realistista kasvua havaittu yli 10,8 g-L-1:n voihappopitoisuuksilla.
Lisätyn butyraatin vaikutuksen tutkimiseksi yksityiskohtaisemmin verrattiin villityyppikantojen ja säteilytettyjen kantojen solukasvuprofiileja (OD-mittausten perusteella) (kuva 2A1-G3) fermentoinnin ensimmäisten 54 tunnin aikana. Mielenkiintoista oli, että kantojen voihapon sietokyky parani huomattavasti, kun 12C6+-ionisäteilytyksen energiaa ja annosta lisättiin. C. tyrobutyricum ATCC 25755:n glukoosimetabolian aineenvaihduntareitit on esitetty kuvassa 3. Asetyyli-CoA, asetoasetyyli-CoA ja butyryl-CoA ovat kolme keskeistä välituotetta, ja ne ovat erityisen kiinnostavia fermentoinnin kannalta, kun otetaan huomioon mahdollisuus erilaisten tuotteiden muodostumiseen acidogeneesin tai liuotinogeneesin aikana. Nämä välituotteet ovat tärkeitä haarautumiskohtia, jotka ohjaavat aineenvaihduntavirtaa joko hapon tai liuottimen muodostukseen. Viimeisenä keskeisenä välituotteena butyyryyli-CoA käynnistää voihapon/butyraatin muodostumisen. Butyraatti syntyy PTB:n ja BK:n peräkkäisten toimintojen avulla. Molemmat entsyymit ovat aktiivisimmillaan haponmuodostuksen aikana, ja niiden spesifiset aktiivisuudet vähenevät liuotinmuodostuksen aikana, PTB:n osalta kaksinkertaisiksi ja Buk:n osalta kuusinkertaisiksi. Liuotinogeneesin aikaansaaminen edellyttää yleensä voimakasta pH-riippuvaista aktiivisuutta, jonka in vitro -optimi on happamoittavassa pH:ssa 5,5 (optimi noin pH 4,7) ja in vivo (endogeeninen) pH on yli 5,5. Näiden kuvioiden vertaileva analyysi paljasti kuitenkin selvästi yhden pääklusterin, joka koostuu 68 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyistä kannoista sekä 114 AMeV:llä ja 30 ja 40 Gy:n annoksilla säteilytetyistä kannoista. Nämä kaksi ryhmää osoittivat hyvin samanlaista yleistä sietokykyä kasvaville butyraattipitoisuuksille verrattuna villityyppisiin bakteereihin.
Glukoosiaineenvaihdunnan metaboliset reitit Clostridium tyrobutyricum -bakteerissa . Entsyymit on merkitty kirjaimilla seuraavasti: laktaattidehydrogenaasi; pyruvaatti-ferdoksiinioksidoreduktaasi; NADH-ferdoksiinioksidoreduktaasi; NADPH-ferdoksiinioksidoreduktaasi; hydrogenaasi; fosfaattiasetyylitransferaasi (fosforitransasetaasi); asetaattikinaasi; asetaldehydidehydrogenaasi; etanolidehydrogenaasi; tiolaasi (asetyyli-CoA- asetyylitransferaasi); asetoasetyyli-CoA:n; asetaatti/butyraatti:CoA-transferaasi; asetoasetaattidekarboksylaasi; 3-hydroksyylibutyryyli-CoA-dehydrogenaasi; krotonaasi; butyryyli-CoA-dehydrogenaasi; fosfaattibutyltransferaasi (fosfobutyrylaasi); butyraattikinaasi.
12C6+-ionisäteilytyksen vaikutus voihappotuotantoon
Säteilytettyjen kantojen voihappotuotanto parani huomattavasti sekä lopputuotteen konsentraation että saannon osalta verrattuna villiintyneeseen kantaan, kuten kuvassa 4B,E on esitetty. Säteilyttämätön (villityypin kanta, kontrolli) C. tyrobutyricum -viljelmä, joka oli inokuloitu glukoosi-minimaaliseen väliaineeseen, alkoi kuluttaa sokeria lähes välittömästi, ja voihapon tuotanto alkoi 12-18 tuntia myöhemmin (kuva 4A,B). Sama kontrolliviljelmä, joka oli inokuloitu klostridien kasvualustaan (CGM), joka sisälsi 60 g-L-1 glukoosia, tarvitsi yli 96 tuntia totuttautumiseen huolimatta siitä, että säteilytettyjen kantojen ja villityypin kantojen käyminen testattiin samoissa olosuhteissa. Vähäisen aineenvaihdunnan ja tuottavuuden pitkittynyt ajanjakso johtuu siitä, että säteily (eri parametrit) aiheutti viiveen solukasvun log-vaiheessa (kuva 4C,F). Säteilytettyjen kantojen voihapon sietokyky parani huomattavasti, jolloin ne pystyivät tuottamaan enemmän voihappoa, mikä johti täydelliseen glukoosin hyväksikäyttöön ja yli 32 g-L-1 voihapon tuotantoon ja samanlaiseen solubiomassan määrään. Lisäksi voihappo/kontrollisuhde kasvoi villityypin kannan 1,0:sta 1:een.52 114 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyille kannoille, 1,37 114 AMeV:llä ja 30 Gy:llä säteilytetyille kannoille, 1,41 68 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyille kannoille ja 1,31 68 AMeV:llä ja 30 Gy:llä säteilytetyille kannoille. Tämä suuntaus osoittaa, että hiili- ja energiavirrat jakautuivat uudelleen säteilytettyjen kantojen aineenvaihduntareiteillä, mikä johti myös merkittäviin muutoksiin eri käymistuotteiden tuotannossa. On huomattava, että etikkahapon tuotanto (tietoja ei ole esitetty) tasaantui fermentaation aikana paljon aikaisemmin kuin butyraatti/voihappo. Fermentoinnit pysähtyivät, kun solut eivät enää kuluttaneet glukoosia, koska liemeen kertyi orgaanisia happoja ja jätetuotteita, jotka aiheuttivat solujen kasvun ja muiden toimintojen estymistä. Säteilytetyt kannat olivat kuitenkin sietokykyisempiä voihappoa kohtaan, mikä käy ilmi siitä, että näillä säteilytetyillä kannoilla suoritetuissa fermentoinneissa saavutettiin paljon korkeampi lopullinen voihappobutyraattipitoisuus kuin villityypin kannoilla. Tämä ei ole täysin yllättävää; kuten kuvasta 3 käy ilmi, säteilytettyjen kantojen lisääntynyt voihapon sietokyky voi johtua myös vähentyneestä virtauksesta butyraatin PTA/AK-reitin kautta. Koska säteilytetyt kannat eivät enää olleet riippuvaisia PTA/AK-reitistä energiantuotannossa ja eloonjäämisessä, ne olivat vähemmän herkkiä voihapon estolle.
Viljelytyypin ja säteilytetyn C. tyrobutyricum -bakteerin happo- ja biomassan kuivapainotuotannon vertailu, kun sitä kasvatettiin glukoosilla (joka sisälsi 60 g-L-1) klostridiaalisessa kasvualustassa 37 °C:n lämpötilassa pH:n ollessa 5,5 ja 6,0. (A-C) 12C6+-ionisäteilytyksen (energia 68 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy) vaikutus glukoosipitoisuuteen, voihapon tuotantoon ja biomassan kuivapainoon. (D-F) 12C6+-ionisäteilytyksen (energia 114 AMeV ja annokset 20, 30 ja 40 Gy) vaikutus glukoosipitoisuuteen, voihapon tuotantoon ja biomassan kuivapainoon. (G) C. tyrobutyricumin soluproteiinien SDS-PAGE. Kaista WT: villi tyyppi; kaista 1: solut, jotka on säteilytetty 68 AMeV:llä ja annoksella 30 Gy; kaista 2: solut, jotka on säteilytetty 68 AMeV:llä ja annoksella 40 Gy; kaista 3: solut, jotka on säteilytetty 114 AMeV:llä ja annoksella 30 Gy; kaista 4: villi tyyppi ja solut, jotka on säteilytetty 114 AMeV:llä ja annoksella 40 Gy; kaista MW: proteiinien molekyylipainomerkit.
Ack- ja pta-geenien, jotka koodaavat asetaatin muodostumisreittiin liittyviä entsyymejä, induktio parantaa merkittävästi voihapon tuotantoa . Jotta glukoosiaineenvaihdunnan fermentaatiokinetiikkaa ymmärrettäisiin paremmin sen jälkeen, kun C. tyrobutyricum on altistettu 12C6+-ionisäteilytykselle ja siitä johtuvalle ack- ja pta-geenien vaurioitumiselle, tutkittiin ja verrattiin villityypin ja säteilytettyjen kantojen proteiiniekspressiota. Kuvassa 4G esitetään SDS-PAGE:n tulokset. Analyysi vahvisti proteiinin (molekyylipaino noin 85 kDa) ilmentymisen neljässä säteilytetyssä kannassa, ja korkein proteiinin ilmentymistaso oli kaistalla 4. Noin 106 kDa:n proteiinin määrä oli paljon suurempi 114 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyssä kannassa kuin villityypin kannassa. Useista mikro-organismeista peräisin olevia AK- ja PTA-proteiineja on karakterisoitu, mutta tulokset osoittivat suuria vaihteluita niiden molekyylipainossa . Näin ollen tehtiin entsyymiaktiivisuusmäärityksiä AK:n, PTA:n ja PTB:n roolin tarkemmaksi tutkimiseksi happoa muodostavissa reiteissä (kuva 3). C. tyrobutyricumin metaboliseen selektiivisyyteen vaikuttaa kasvuvaihe, sillä eksponentiaalisesti kasvavat viljelmät tuottavat sekä voihappoa että etikkahappoa, kun taas hitaampi stationaarinen kasvu tuottaa yleensä voihappoa . Näin ollen kunkin erän log-vaiheen kasvun aikana viljelynäytteet poistettiin ja analysoitiin PTA:n, PTB:n ja AK:n aktiivisuudet säteilytetyissä ja villityyppisissä kannoissa. PTA:n, PTB:n ja AK:n spesifiset entsyymiaktiivisuudet säteilytetyissä kannoissa (eri fysikaaliset parametrit) määritettiin ja niiden suhteellisia aktiivisuuksia verrattiin villityyppikannan aktiivisuuteen. AK-aktiivisuus väheni noin 47 prosenttia 114 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyissä kannoissa, 31 prosenttia 114 AMeV:llä ja 30 Gy:llä säteilytetyissä kannoissa ja 26 prosenttia 68 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyissä kannoissa. Villityypin kantoihin verrattuna 114 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyillä kannoilla oli alhaisempi AK-aktiivisuus (47 %) mutta odottamattoman korkeampi PTA-aktiivisuus (129 %), vaikka PTB-aktiivisuus oli samanlainen. Koska 114 AMeV:llä säteilytetyillä kannoilla oli paljon alhaisempi AK-aktiivisuus, PTA-AK-reitti olisi heikentynyt, ja näin ollen ne tuottivat glukoosista enemmän butyraattia (60 g-L-1) kuin villityypin kannat. Kuten aiemmin mainittiin, nämä lisäykset ja parannukset voivat johtua lisääntyneestä sietokyvystä butyraatin estoa kohtaan ja jossain määrin pienentyneestä hiilivirrasta PTA-AK-reitin kautta, mistä on osoituksena säteilytettyjen kantojen lisääntynyt butyraatti/asetaatti-suhde.
12C6+-säteilytyksen vaikutus C. tyrobutyricumin happotuotokseen ja kasvuun
Koe suoritettiin fermentointitilassa käyttäen glukoosia ensisijaisena hiililähteenä C. tyrobutyricum ATCC 25755:n butyraatin tuotantokapasiteetin määrittämiseksi säteilytyksen jälkeen. Kuten kuvasta 5A,B nähdään, voihapon tuotto glukoosista kasvoi merkittävästi, 0,43 g-g-1:stä villityypin kannassa 0,56 g-g-1:een kannassa, jota säteilytettiin 68 AMeV:llä ja 30 Gy:n annoksella, 0.59 g-g-1 68 AMeV:llä ja 40 Gy:n annoksella säteilytetyssä kannassa, 0,63 g-g-1 114 AMeV:llä ja 30 Gy:n annoksella säteilytetyssä kannassa ja 0,66 g-g-1 114 AMeV:llä ja 40 Gy:n annoksella säteilytetyssä kannassa. On huomattava, että 114 AMeV:llä ja 40 Gy:n annoksella säteilytetyn kannan butyraatin tuotto olisi ollut suurempi (>0,66 g-g-1), jos glukoosin kulutus viiveen aikana olisi jätetty huomiotta. 68 AMeV:llä ja 30 ja 40 Gy:n annoksilla säteilytetyn kannan tuottama etikkahappo oli samanlainen kuin villityypin. Kuitenkin 114 AMeV:llä ja 30 ja 40 Gy:n annoksilla säteilytetyn kannan tuottama etikkahappo väheni villityypin tuotantoon verrattuna. Kuten kuvasta 5B käy ilmi, etikkahapon tuotto glukoosista väheni myös merkittävästi, villityypin kannan noin 0,11 g-g-1:stä noin 0,08 g-g-1:een 114 AMeV:llä ja 30 Gy:llä säteilytetyssä kannassa ja noin 0,07 g-g-1:een 114 AMeV:llä ja 40 Gy:llä säteilytetyssä kannassa. Kuitenkin butyraatti/asetaatti-suhde (g/g) kasvoi villityypin kannan 3,99:stä 5,82:een säteilytetyissä kannoissa, mikä on selvä osoitus siitä, että aineenvaihduntareitit säteilytetyissä kannoissa siirtyivät suosimaan voihapon tuotantoa etikkahapon tuotannon sijaan. Kuten kuvasta 3 käy ilmi, koska AK- ja PTA-aktiivisuus väheni merkittävästi säteilytetyissä kannoissa, enemmän pyruvaattia on täytynyt kataboloida butyraattia tuottavan reitin kautta, mikä on johtanut suurempaan butyraatin saantoon glukoosista. Lisäksi voihappo on voinut myös edistää aikaisempaa siirtymistä happoa tuottavaan reittiin, mikä saattaa näkyä hitaampana kasvunopeutena. Samasta syystä säteilytetyt näytteet kärsivät hitaammasta kasvuvauhdista, koska vähemmän ATP:tä tuotettiin asetaattia tuottavasta (PTA-AK) reitistä, joka normaalisti pystyy tuottamaan enemmän ATP:tä muunnettua glukoosimoolia kohti kuin butyraattia tuottava (PTB-BK) reitti.
Happotuotannon vertailu villityypin ja säteilytettyjen C. tyrobutyricum -solujen välillä. (A) Viinihapon ja etikkahapon tuotanto arvioitiin lineaaristen kuvaajien kaltevuudesta villityypin soluille ja 68 AMeV:llä ja 30 ja 40 Gy:n annoksilla säteilytetyille soluille. (B) Viinihapon ja etikkahapon tuotanto arvioitiin lineaaristen piirrosten kaltevuuksista villityypin soluille ja soluille, jotka säteilytettiin 114 AMeV:llä ja 30 ja 40 Gy:n annoksilla. (C) Biomassan kuivapainon kineettisten kasvuprofiilien linearisointi (integrointi) ajan funktiona käyttäen luonnollisen logaritmin muunnosta. Villityypin ja säteilytettyjen solujen maksimaaliset spesifiset kasvunopeudet laskettiin esimerkin mukaisesti 114 AMeV:llä ja 40 Gy:n annoksella säteilytetyille soluille, joita kasvatettiin Clostridium-kasvatusalustassa, joka sisälsi 60 g-L-1 glukoosia. BDW, biomassan kuivapaino.
Tämän jälkeen määritettiin μ max:n kuvaaja suurilla alkuperäisillä glukoosipitoisuuksilla (40, 60, 80 ja 120 g-L-1) sovittamalla käymisdataa mallisimulaation ennusteisiin. Biomassan kuivapainon (BDW) kineettisten kasvuprofiilien linearisointi (integrointi) ajan funktiona saavutettiin käyttämällä luonnollisen logaritmin muunnosta:
Jossa x(t) = BDW-konsentraatio jokaisella hetkellä x 0 ; t = BDW:n alkupitoisuus; μ max = suurin ominaiskasvunopeus (h-1); ja ominaiskasvunopeus on μ = (1/x(t)). – (dx/dt). Yksinkertaisuuden vuoksi oletettiin, että kaikki bakteerit noudattavat eksponentiaalista solukasvulakia eräkasvatuksessa ensimmäisen kertaluvun kineettisen mallin mukaisesti. Solujen spesifinen kasvunopeus eli solumassan lisääntyminen ajan myötä merkitsee selektiivisyyden muuttumista eri kasvunopeuksilla, millä on merkittävä vaikutus käymisprosessiin . Solujen nopea kasvu vaatii enemmän energiaa ja tuottaa ensisijaisesti etikkahappoa. Alhaisilla kasvunopeuksilla etikkahappoa tuotetaan mieluummin voihappoa kuin etikkahappoa . Jatkuvassa fermentoinnissa butyraatti-/voihappotuotanto on suurempaa, kun μ on pienempi. Kun μ lähestyy nollaa, tuottavuudessa tapahtuu värähtelyä . Nämä yhtälöt mahdollistavat erä- ja jatkuvan järjestelmän kasvunopeuden vertailun villityypin ja säteilytettyjen kantojen osalta.
Malli ei ole väliaineesta riippumaton: edellä kuvatulla tavalla käytetty väliaine vaikuttaa sekä solujen kasvunopeuteen että tuotettujen butyraatti-/voihappomäärien määrään, ja erilaiset glukoosin kulutusprofiilit tuottaisivat erilaisia tuloksia. Jotta solukasvun kannalta optimaalinen glukoosipitoisuus voitaisiin määrittää paremmin, maksimaaliset spesifiset kasvunopeudet määritettiin villityypin ja säteilytettyjen kantojen osalta eksponentiaalisesta kasvuvaiheesta otetuista kineettisistä tiedoista ja piirrettiin lisättyä glukoosipitoisuutta vasten. Kuten kuvasta 5C nähdään, 114 AMeV:llä ja 40 Gy:n annoksella säteilytettyjen kantojen maksimaaliset spesifiset kasvunopeudet laskettiin sen esimerkin mukaisesti, jossa kantaa kasvatettiin CGM-mediassa, joka sisälsi 60 g-L-1 glukoosia. Tietopisteistä valittiin paras lineaarinen alue, joka vastasi kannan eksponentiaalista kasvuvaihetta. Joissakin tapauksissa, joissa kolmen kokeellisen datapisteen vähimmäisvaatimus ei täyttynyt, käytettiin vaihtoehtoista ilmaisua, jossa otettiin huomioon vain kaksi ääripistettä (eksponentiaalisen vaiheen alussa ja lopussa). Suoran kaltevuus (m = μmax) antaa maksimaalisen ominaiskasvunopeuden (0,213 h-1). Yhdensuuntaisen lineaarisen regressiomallin (y = 0,2129x – 2,6457) oikaistu määrityskerroin oli R2 = 0,9765, mikä osoittaa, että kaikki datapisteet sisältyivät parhaan sovituksen suoralle eikä yksikään datapiste poikennut tästä suorasta. Lisäksi kukin spesifinen kasvunopeus arvioitiin BDW:n ja ajan välisen puolilogaritmisen kuvaajan kaltevuuden perusteella. Virhepalkit on ilmaistu standardipoikkeamana (SD), joka on saatu säteilytettyjen kantojen ja villityypin kunkin riippumattoman käymisreplikaatin laskelmista (alkuperäisiä tietoja ei ole esitetty). Tulokset osoittavat, että näillä säteilytetyillä kannoilla oli huomattavasti alhaisempi spesifinen kasvunopeus (μ = 0,38 ±0,03-0,21 ±0,02 h-1) verrattuna villityyppiin (μ = 0,38-0,42 h-1). 12C6+-ionisäteilytyksen käyttö 68 AMeV:n, 20-40 Gy:n ja 106-108 ionipulssin-1 avulla johti erityisen pitkiin 10, 12 ja 16 tunnin viiveisiin. Vertailun vuoksi 12C6+-ionisäteilytyksen käyttö 114 AMeV:n, 20-40 Gy:n ja 106-108 ionipulssin-1 yhteydessä johti vastaavasti 12, 18 ja 24 tunnin viiveisiin. Nämä pidemmät viiveajat voivat osittain johtua erilaisista säteilyparametreista ja fermentoinnissa käytetystä alhaisesta inokulaatiotiheydestä. Säteilyllä säteilytettyjen solujen alhaisempi spesifinen kasvuvauhti voi johtua soluihin kohdistuvasta aineenvaihdunnallisesta kuormituksesta, joka johtuu glukoosiaineenvaihdunnan tuottaman energian vähäisemmästä määrästä, joka johtuu suuremmalla energialla ja suuremmilla annoksilla aiheutuneista vaurioista. Verrattuna villityypin kantoihin 20 ja 30 Gy:n säteilytyksellä 68 AMeV:llä säteilytetyillä kannoilla oli samanlaiset kasvu- ja glukoosinkulutusprofiilit, ja niiden spesifinen kasvunopeus oli lähes identtinen μ = 0,42 ±0.03 h-1, kun taas 30 ja 40 Gy:llä säteilytetyillä kannoilla 114 AMeV:ssä oli huomattavasti pidempi viivefaasi, hitaampi glukoosin kulutus ja paljon alhaisempi spesifinen kasvunopeus μ = 0,26 ±0,03 h-1 (30 Gy) ja μ = 0,21 ±0,02 h-1 (40 Gy).
Kuten aiemmin todettiin, asetaattia syntetisoidaan PTA- ja AK-reaktioiden välityksellä, joista jälkimmäinen syntetisoi ATP:tä (kuva 3). Butyraatin biosynteesissä kaksi asetyyli-CoA-molekyyliä kondensoituu asetoasetyyli-CoA:ksi, jota seuraa pelkistyminen butyryl-CoA:ksi, joka sitten muunnetaan butyraatiksi PTB- ja BK-reaktioiden kautta ATP:tä tuottaen. Säteilyllä säteilytettyjen kantojen (energia 114 AMeV ja annokset 30 ja 40 Gy) alhaisempi spesifinen kasvuvauhti voi johtua solujen aineenvaihdunnallisesta kuormituksesta, joka aiheutuu siitä, että glukoosiaineenvaihdunnan aikana syntyy vähemmän energiaa (ATP:tä) ack:n ja pta:n säteilyvaurioiden vuoksi. Myös säteilytettyjen kantojen glukoosin BDW vaihteli villityypin kannoista. BDW:n kuvaaja säteilytettyjen kantojen ajan ja spesifisen kasvunopeuden suhteen osoitti, että hiili- ja energiavirta jakautui uudelleen näiden kantojen aineenvaihduntareittien kesken, mikä johti myös merkittäviin muutoksiin käymistuotteiden happotuotannossa.