Regulation of acetate and acetyl-CoA:ta konvertoivien entsyymien säätely asetaatilla ja/tai glukoosilla kasvamisen aikana halofiilisessä arkeonissa Haloarcula marismortui

Abstract

Haloarcula marismortui muodosti asetaattia aerobisen kasvun aikana glukoosilla ja hyödynsi asetaattia kasvualustana. Glukoosin ja asetaatin seoksilla havaittiin diauksinen kasvu, jossa glukoosi oli ensisijainen substraatti. Glukoosi- ja asetaattiaineenvaihduntaan liittyvien entsyymiaktiivisuuksien säätelyä analysoitiin. Havaittiin, että sekä glukoosidehydrogenaasi (GDH) että ADP:tä muodostava asetyyli-CoA-syntetaasi (ACD) olivat säänneltyjä glukoosin kulutuksen ja asetaatin muodostuksen aikana, kun taas AMP:tä muodostava asetyyli-CoA-syntetaasi (ACS) ja malaattisyntetaasi (MS) olivat säänneltyjä alaspäin. Sitä vastoin ACS:n ja MS:n ylössäätelyä ja ACD:n ja GDH:n alasäätelyä havaittiin asetaatin kulutuksen aikana. MS:n säätely lisääntyi myös peptidikasvun aikana ilman asetaattia. Tietojen perusteella voimme päätellä, että glukoosin indusoima ACD katalysoi asetaatin muodostumista, kun taas asetaatin aktivoitumista katalysoi asetaatin indusoima ACS; sekä ACS että MS indusoituvat ilmeisesti asetaatin vaikutuksesta ja tukahdutetaan glukoosin vaikutuksesta.

1 Johdanto

Erilaiset halofiiliset arkeologit, mukaan lukien Haloarcula marismortui, kasvavat glukoosilla, joka hajotetaan modifioidun, puolifosforyloidun Entner-Doudoroff (ED) -reitin kautta . On osoitettu, että eksponentiaalisen kasvun aikana glukoosilla muodostuu merkittäviä määriä asetaattia . Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että asetaatin muodostumista asetyyli-CoA:sta halofiilisissä arkeoissa katalysoi ADP:tä muodostava asetyyli-CoA-syntetaasi (ACD) (asetyyli-CoA + ADP + Pi⇆ asetaatti + ATP + CoA). Tämä epätavallinen syntetaasi löytyi kaikista asetaattia muodostavista arkeoista, mukaan lukien anaerobiset hypertermofiilit, ja se edustaa prokaryoottien uutta mekanismia asetaatin muodostuksessa ja ATP-synteesissä. Anaerobisissa hypertermofiileissä arkeoissa, kuten Pyrococcus furiosuksessa, ACD on tärkein energiaa säästävä reaktio sokeri-, pyruvaatti- ja peptidimetabolian aikana. Toisin kuin arkeaalien yhden entsyymin mekanismi, kaikki bakteerit käyttävät ”klassista” kahden entsyymin mekanismia asetyyli-CoA:n muuntamiseen asetaatiksi, johon osallistuvat fosfaattiasetyylitransferaasi (PTA) ja asetaattikinaasi (AK) .

Monien haloarkaalien, mukaan lukien H. marismortui, Haloferax volcanii ja Halorubrum saccharovorum, on raportoitu kasvaneen asetaatilla substraattina. Asetaatin aineenvaihdunta alkaa sen aktivoitumisesta asetyyli-CoA:ksi. Esitimme äskettäin ensimmäiset todisteet siitä, että asetaatin aktivoitumista asetyyli-CoA:ksi haloarkaaioissa katalysoi AMP:tä muodostava asetyyli-CoA-syntetaasi (ACS) (asetaatti + ATP + CoA → asetyyli-CoA + AMP + PPi) . ACS on tärkein asetaattia aktivoiva entsyymi useimmille asetaattia käyttäville organismeille kaikilla kolmella elämänalueella . Vain harvat bakteerit, kuten Corynebacterium glutamicum, ja myös asetoklastinen metanogeeninen arkeoni Methanosarcina ssp. aktivoivat asetaattia asetyyli-CoA:ksi AK/PTA-parin kautta . Siten AK/PTA-reitti voi toimia in vivo palautuvasti eli sekä asetaatin muodostumisen että asetaatin aktivoitumisen suuntaan. Sitä vastoin ensimmäiset analyysit viittaavat siihen, että haloarchaeaeissa ACD, AK/PTA-parin arkeaalinen vastine, toimii in vivo asetaatin muodostuksen suuntaan, vaikka entsyymi katalysoi käänteistä reaktiota in vitro.

Fysiologisen roolin tarkemmaksi selvittämiseksi ja saadaksemme ensimmäiset näkemykset asetaattia ja asetyyli-CoA:ta konvertoivien entsyymien substraattiriippuvaisesta säätelystä haloarchaeaeissa suoritimme substraattisiirtymäkokeita H. marismortuilla ja analysoimme kasvua glukoosilla, asetaatilla, glukoosi/asetaatti-seoksilla ja peptideillä. Kasvun aikana analysoitiin asetaattia ja asetyyli-CoA:ta konvertoivien entsyymien, ACD:n ja ACS:n, sekä glukoosidehydrogenaasin, joka on ensimmäinen entsyymi glukoosin hajotuksessa modifioidun ED-reitin kautta, aktiivisuusprofiileja. Lisäksi määritettiin malaattisyntaasin, yhden glyoksylaattikierron avainentsyymin, jonka on ehdotettu olevan toiminnassa haloarchaea-organismeissa, aktiivisuus.

2 Materiaalit ja menetelmät

2.1 Kasvu H. marismortuin kasvattaminen glukoosilla, asetaatilla, glukoosin ja asetaatin seoksilla ja peptideillä

Haloarcula marismortuita kasvatettiin aerobisesti 37 °C:ssa kompleksisessa elatusaineessa, joka sisälsi hiivauutetta, kasaminohappoja ja lisäksi glukoosia ja/tai asetaattia aiemmin kuvatulla tavalla . Glukoosin ja asetaatin seoksella kasvattamista varten väliaineeseen lisättiin 12,5 mM glukoosia ja 30 mM asetaattia. Peptidien kasvatus suoritettiin kompleksisessa väliaineessa ilman asetaattia ja glukoosia. Kasvukokeet tehtiin 2 litran fermentoreissa (fairmen tec, Saksa), joissa sekoittimen nopeus oli 500 rpm ja paineilman läpivirtaus 600 ml minuutissa. Kasvua seurattiin mittaamalla optinen tiheys 578 nm:ssä (ΔOD578). ΔOD578 1 vastasi proteiinipitoisuutta 0,5-0,6 mg/ml. Glukoosi ja asetaatti määritettiin entsymaattisesti, kuten on kuvattu kohdassa .

2.2 Soluuutteiden valmistaminen

H. marismortuin solut (100-200 ml viljelmää) kerättiin eri kasvuvaiheissa ja soluuutteet valmistettiin, kuten on kuvattu kohdassa . Proteiini määritettiin Bradfordin menetelmällä käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina.

2.3 Entsyymiaktiivisuuden määrittäminen

Kaikki entsyymimääritykset tehtiin aerobisissa olosuhteissa 37 °C:n lämpötilassa 1 ml:lla määritysseosta täytetyissä kyveteissä. Apuentsyymit lisättiin yleensä juuri ennen reaktion aloittamista, ja varmistettiin, että nämä entsyymit eivät olleet nopeutta rajoittavia. Yksi yksikkö (1 U) entsyymiaktiivisuutta määritellään 1 μmol:ksi substraatin kulutukseksi tai muodostuneeksi tuotteeksi minuutissa.

• Asetyyli-CoA-syntetaasi (ADP:tä muodostava) (ACD) (E.C. 6.2.1.13) mitattiin kuten on kuvattu kohdassa.

• Asetyyli-CoA-syntetaasi (AMP:tä muodostava) (ACS) (E.C. 6.2.1.1.) seurattiin PPi:stä ja AMP:stä riippuvaisena HSCoA:n vapautumisena asetyyli-CoA:sta Srere et al. mukaan Ellmanin tiolireagenssilla, 5′5-ditiobis(2-nitrobentsoehapolla) (DTNB), mittaamalla tiofenolaattianionin muodostumista 412 nm:ssä (ε412= 13,6 mM-1 cm-1). Määritysseos sisälsi 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,25 M KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB:tä, 1 mM asetyyli-CoA:ta, 2 mM AMP:tä, 2 mM PPi:tä ja uutetta.

• Malaattisyntaasia (E.C. 4.1.3.2.) seurattiin modifioidussa määrityksessä Serranon ym. mukaan DTNB:n avulla. Määritysseos sisälsi 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 0,2 mM asetyyli-CoA, 0,5 mM glyoksylaattia ja uutetta.

• Glukoosidehydrogenaasi (E.C. 1.1.1.1.47) mitattiin Johnsenin ym. mukaan. .

• Asetaattikinaasi (E.C. 2.7.2.1.) mitattiin kohdassa kuvatulla tavalla .

• Fosfotransaasetaasi (E.C. 2.3.1.8.) seurattiin Pi:stä riippuvaisena HSCoA:n vapautumisena asetyyli-CoA:sta DTNB:llä . Testiseos sisälsi 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 M KCl, 30 mM MgCl2, 0,1 mM DTNB, 1,5 mM asetyyli-CoA, 5 mM KH2PO4 ja uutetta.

3 Tulokset

Asetaatti- ja asetyyli-CoA-aineenvaihduntaan liittyvien entsyymien fysiologista toimintaa ja säätelyä selvitettiin soluilla H. marismortui, joita oli kasvatettu valmiiksi eri substraateilla, siirrettiin väliaineeseen, joka sisälsi asetaattia ja/tai glukoosia ja vastaavasti peptidejä, ja analysoitiin ACD:n, ACS:n, GDH:n ja MS:n aktiivisuusprofiileja.

3.1 Asetaattiin sopeutuneiden solujen kasvu glukoosilla

Viivytysvaiheen jälkeen solut kasvoivat eksponentiaalisesti, ja glukoosi kulutettiin kokonaan. Samanaikaisesti glukoosin kulutuksen kanssa muodostui merkittäviä määriä asetaattia. Tänä aikana sekä GDH:n että ACD:n aktiivisuus lisääntyi, kun taas ACS:n ja MS:n, jotka olivat aktiivisia asetaattiin sopeutuneissa soluissa, aktiivisuus väheni täysin. Stationaarisessa vaiheessa erittynyt asetaatti otettiin kokonaan uudelleen käyttöön ja sekä ACS:n että MS:n aktiivisuudet kasvoivat, kun taas GDH:n ja ACD:n aktiivisuudet laskivat (kuva 1).

3.2 Glukoosiin sopeutuneiden solujen kasvu asetaatilla

Glukoosiin sopeutuneet solut kasvoivat aluksi (noin 30 h) asetaattia sisältävässä väliaineessa kaksinkertaistumisaikana 10 h, kunnes optinen tiheys (ΔOD578) oli 1. Tässä kasvuvaiheessa ei havaittu asetaatin kulutusta, ja solut kasvoivat väliaineessa olevilla peptideillä. Tämän jakson jälkeen solut kasvoivat pienemmällä kasvuvauhdilla, kunnes ΔOD578 oli 1,8 ja asetaatti kului kokonaan. Asetaatin kulutuksen aikana ACD- ja GDH-aktiivisuudet vähenivät, kun taas ACS- ja MS-aktiivisuudet, joita ei voitu havaita glukoosiin sopeutuneissa soluissa, kasvoivat. MS-aktiivisuuden kasvu alkoi peptideillä kasvamisen aikana, kun taas ACS-aktiivisuuden kasvu oli samansuuntainen asetaatin kulutuksen kanssa (kuva 2).

3.3 Kasvu glukoosi/asetaattiseoksessa

Hiivauutteeseen ja kasaminohappoihin sopeutuneita H. marismortui -soluja siirrettiin väliaineeseen, joka sisälsi sekä glukoosia että asetaattia. Solut osoittivat diuksista kasvua, jossa ensimmäinen glukoosi ja toinen asetaatti hyödynnettiin peräkkäin. Ensimmäisessä kasvuvaiheessa solut kasvoivat, kunnes ΔOD578 oli 4,0, ja glukoosi kulutettiin. Glukoosin kulutuksen ja lyhyen viiveen jälkeen solut siirtyivät toiseen kasvuvaiheeseen, jossa asetaattia metaboloitiin ja solut kasvoivat lopulliseen ΔOD578-arvoon 5,2. Ensimmäisessä kasvuvaiheessa, joka oli rinnakkainen glukoosin kulutuksen kanssa, ACD- ja GDH-aktiivisuus lisääntyi, kun taas ACS-aktiivisuutta ei voitu havaita ja MS-aktiivisuus oli täysin alasreguloitunut. Toisessa kasvuvaiheessa, joka oli samansuuntainen asetaatin käytön kanssa, ACS- ja MS-aktiivisuudet lisääntyivät ja ACD- ja GDH-aktiivisuudet vähenivät (kuva 3).

3.4 Glukoosiin sopeutuneet solut peptideillä

Glukoosiin sopeutuneet solut siirrettiin väliaineeseen, joka sisälsi sekä glukoosin että asetaatin puuttuessa 0,25 %:n hiivauutetta ja 0,5 %:n pitoisuuksina kasaminohappoja. Solut kasvoivat 13 tunnin kaksinkertaistumisajalla, kunnes ΔOD578 oli 2,5. Asetaatin muodostumista ei voitu havaita. Eksponentiaalisen kasvun aikana ACD (60 mU/mg:sta 20 mU/mg:aan) ja GDH (80 mU/mg:sta 40 mU/mg:aan) vähenivät, ja MS-aktiivisuus, jota ei aluksi voitu havaita, kasvoi 20 mU/mg:aan. ACS:n aktiivisuutta ei voitu havaita eksponentiaalisen kasvuvaiheen aikana, mutta se lisääntyi stationaarivaiheen aikana (13 mU/mg).

4 Pohdinta

Tässä artikkelissa analysoimme asetaattia ja asetyyli-CoA:ta konvertoivien entsyymien (ACD, ACS) fysiologista roolia H. marismortuissa ja annoimme ensimmäiset todisteet näiden entsyymien sekä GDH:n ja MS:n substraattispesifisestä sääntelystä. Tietoja käsitellään verrattaessa niitä tunnettuihin bakteerisysteemeihin.

4.1 H. marismortuin asetaatinmuodostus on ACD:n katalysoimaa osana ”ylivuotoaineenvaihduntaa”

Kasvattaessa glukoosilla ja glukoosin ja asetaatin seoksilla sekä ACD:n että GDH:n aktiivisuus lisääntyi samansuuntaisesti glukoosin kuluttamisen ja asetaatinmuodostuksen vaiheiden kanssa (kuvat 1 ja 3). Sitä vastoin molemmat aktiivisuudet vähenivät asetaatilla tai peptideillä tapahtuvan kasvun aikana. Nämä tiedot ja AK/PTA:n puuttuminen osoittavat, että asetaatin muodostumista Haloarculassa katalysoi ACD. Asetaatin muodostumisen fysiologista merkitystä H. marismortuissa ja sen säätelyä aerobisen kasvun aikana glukoosilla ei tunneta; asetaatin muodostuminen saattaa olla osa ”ylivuotoaineenvaihduntaa”, jota on tutkittu jonkin verran yksityiskohtaisesti eri bakteereissa, kuten Escherichia coli ja Bacillus subtilis. Kuten H. marismortuilla, molemmat bakteerit erittävät asetaattia aerobisen kasvun aikana ylimääräisellä glukoosilla ja käyttävät sen uudelleen stationaarivaiheessa. On arveltu, että asetaattia erittyy olosuhteissa, joissa glykolyysin nopeus ylittää myöhempien reittien, kuten sitruunahappokierron ja glukoosin täydelliseen hapettumiseen tarvittavan hengityksen, nopeuden. Näissä olosuhteissa asetyyli-CoA muuttuu asetaatiksi ja erittyy. Tämän näkemyksen mukaisesti sekä E. coli- että B. subtilis -organismeilla tehdyt transkriptioanalyysit osoittavat, että glykolyyttisten geenien induktio on glukoosispesifinen ja sitruunahappokierron ja hengityksen geenien repressio . Samankaltainen glukoosispesifinen transkriptionaalinen säätely eli muunnetun Entner-Doudoroff-reitin glykolyyttisten geenien säätely ylöspäin ja joidenkin sitruunahappokierron ja hengityksen geenien alaspäin säätely on äskettäin raportoitu halofiilisen arkeonin H. volcanii osalta. Näin ollen haloarkeeneissa glukoosispesifinen ylivirtausmetabolia, joka johtaa asetaatin muodostumiseen, on todennäköinen. Asetaatin muodostumiseen E. coli- ja B. subtilis -bakteereissa liittyy bakteerien kahden entsyymin mekanismi PTA:n ja AK:n kautta, kun taas Haloarculassa asetaatin muodostumista katalysoi ACD, arkeaalien yhden entsyymin mekanismi. Sekä E. colissa että B. subtiliksessa glukoosin havaittiin indusoivan pta- ja ack-geenejä koodaavia geenejä, mikä osoittaa glykolyysin ja asetaatin muodostumisen koordinoitua säätelyä. Toistaiseksi ei ole analysoitu asetaattia muodostavan ACD:n transkriptiosäätelyä arkeonissa H. marismortui. GDH:n ja ACD:n aktiivisuuden koordinoitu säätely viittaa kuitenkin samanlaiseen glukoosispesifiseen transkriptionaaliseen säätelyyn sekä glykolyysin modifioidulla Entner-Doudoroff-reitillä että asetaatinmuodostuksen ACD:llä.

Aerobisessa kasvussa peptideillä H. marismortui ei muodostanut asetaattia, ja ACD:n aktiivisuus oli alasäätynyt. Tässä suhteessa Haloarcula eroaa bakteerista E. coli, joka muodostaa merkittäviä määriä asetaattia aerobisen kasvun aikana peptideillä ”ylivuotoaineenvaihdunnan” aikana. H. marismortui eroaa myös anaerobisesta hypertermofiilisestä arkeonista P. furiosus ja muista anaerobisista hypertermofiilisistä arkeoneista, jotka muodostavat suuria määriä asetaattia ACD:n avulla anaerobisen kasvun aikana sekä sokereilla että peptideillä. P. furiosuksen anaerobisen peptidi- ja sokerifermentaation aikana asetaatin muodostuminen ACD:n avulla on tärkein paikka ATP:n muodostumiselle substraattitason fosforylaation kautta ; sitä vastoin H. marismortuin aerobisen sokerien ja peptidien hajoamisen aikana suurin osa energiasta säilyy elektroninsiirtofosforylaatiossa hengitysketjussa, ja näin ollen asetaatin muodostuminen ACD:n avulla ei ole yhtä merkittävää tai tarpeetonta. Näin ollen ACD:n suorittama asetaatin muodostus Haloarculassa näyttää rajoittuvan sokeriaineenvaihduntaan ”ylivuotoaineenvaihdunnan” aikana.

4.2 Asetaatin aktivoituminen asetyyli-CoA:ksi H. marismortuissa katalysoi ACS

Tämä päätellään ACS:n aktiivisuuden kohoamisesta samansuuntaisesti asetaattikulutuksen kanssa (kuvat 1, 2, 3). ACS:n rooli asetaatin aktivoinnissa voitiin sulkea pois, koska ACS:n säätely väheni asetaatin kulutuksen aikana. Näin ollen ACD toimii Haloarculassa in vivo vain asetaatin muodostumisen suuntaan. ACD on myös yleisin asetaatin aktivaatiomekanismi bakteereissa, joissa se on tiukasti säädelty; esimerkiksi E. coli- ja B. subtilis -bakteereissa acs-geeni indusoituu asetaatin vaikutuksesta ja tukahdutetaan glukoosin vaikutuksesta. Haloarculassa ACS-aktiivisuuden nousu asetaatin vaikutuksesta ja lasku glukoosin vaikutuksesta viittaavat samanlaiseen transkriptiotasolla tapahtuvaan säätelyyn kuin bakteerien osalta on raportoitu. On huomattava, että toisin kuin E. coli ja B. subtilis, C. glutamicum -bakteeri aktivoi asetaatin asetaatin indusoimalla AK/PTA-reitillä .

Glyoksylaattikierron keskeisen entsyymin MS:n aktiivisuus oli H. marismortuinissa asetaatin kulutuksen aikana yhdessä ACS:n kanssa ylössäätelemässä, mikä viittaa asetaattispesifiseen koordinaattisäätelyyn ACS:n ja anapleroottisen glyoksylaattikierron välillä. Glukoosi sääteli sekä MS- että ACS-aktiivisuutta alaspäin. Useiden bakteerien, kuten E. coli ja C. glutamicum, osalta on raportoitu asetaatti-spesifistä asetaatin aktivaatioentsyymien (ks. edellä) ja glyoksylaattireitin geenien koordinoitua induktiota. Hiljattain on saatu ensimmäiset todisteet sekä malaattisyntaasi- että isositraattilyaasigeenien induktiosta asetaatin vaikutuksesta halofiiliseen arkeoniin H. volcanii.

Mutta MS-aktiivisuus ACS-aktiivisuuden sijasta säätyi myös eksponentiaalisen kasvun aikana peptideillä ilman asetaattia, mikä osoittaa, että MS:n säätely on monimutkaisempaa eikä rajoitu asetaattiin. MS:n (ja glyoksylaattikierron) rooli peptidien aineenvaihdunnassa saattaisi selittyä sillä, että monet aminohapot hajoavat asetyyli-CoA:ksi, mikä edellyttäisi toimivaa glyoksylaattireittiä anabolismia varten. ACS-aktiivisuuden lisääntymistä, joka havaittiin stationaarivaiheessa peptidikasvun aikana, ei voida toistaiseksi selittää, vaan se saattaa johtua stationaarivaiheen solujen yleisestä stressivasteesta.

4.3 Glukoosispesifinen katabolian repressio H. marismortuilla

Haloarcula marismortui osoitti diuksista kasvua glukoosi-asetaattiseoksilla glukoosin ollessa ensisijaisena substraattina, mikä viittaa jonkinlaiseen asetaatin hyväksikäytön kataboliseen tukahduttamiseen glukoosin avulla. Glukoosispesifistä kataboliittirepressiota ei ole toistaiseksi analysoitu arkeoissa. Bakteereissa glukoosin aiheuttaman hiilikataboliittirepression molekyyliperustaa on tutkittu yksityiskohtaisesti esimerkiksi E. coli- ja B. subtilis -bakteereissa. C. glutamicumin kasvaessa glukoosi-asetaattiseoksilla kuvattiin monofaasista kasvua, jossa asetaattia ja glukoosia kulutetaan samanaikaisesti, kun taas Azotobacter vinelandii -bakteerissa asetaatti on ensisijainen substraatti. Näiden ominaisuuksien taustalla olevia säätelyperiaatteita tutkitaan parhaillaan .

Jatkotutkimukset ovat tarpeen, jotta voidaan perustella asetaattia muodostavien ja asetaattia aktivoivien entsyymien, ACD:n ja ACS:n, ehdotettua substraattispesifistä säätelyä suhteessa asetaatti- ja glukoosiaineenvaihduntaan transkriptiotasolla. Nämä tutkimukset, jotka edellyttävät H. marismortuin ACD:n ja ACS:n ACD:tä ja ACS:ää koodaavien geenien puhdistamista ja tunnistamista, ovat parhaillaan käynnissä.

(

)

.

,

–

.

.

,

–

.

(

)

:ssä.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

Author notes