5-hidroximetilcitozina și rolurile sale potențiale în dezvoltare și cancer

Rolul dublu al 5-hidroximetilcitozinei ca bază stabilă a ADN-ului și ca intermediar în demetilarea ADN-ului

Știm acum că nivelurile de 5hmC variază substanțial între diferite tipuri de celule și țesuturi și sunt cele mai ridicate în creier, în special în neuroni. Deoarece 5hmC este un produs de oxidare a 5mC, este clar că formarea de 5hmC din 5mC scade automat nivelurile de 5mC în orice poziție nucleotidică dată sau chiar la nivelul întregului genom. Prin urmare, a fost imediat evident că transformarea 5mC în 5hmC ar putea fi primul pas într-o cale care duce la demetilarea ADN-ului. Există dovezi din diferite sisteme experimentale care arată că acest lucru ar putea fi, într-adevăr, cazul . Rezultatul final al acestei căi de demetilare este îndepărtarea pasivă sau activă a bazei modificate și/sau dispariția grupării metil din citosina din ADN (figura 1). În calea de demetilare pasivă, 5hmC nu poate fi copiat de către ADN metiltransferaza de întreținere, DNMT1, o enzimă care propagă modelele de metilare preexistente și care acționează asupra situsurilor CpG hemimetilate . Procesul de demetilare activă care utilizează 5hmC ca intermediar este considerabil mai complicat. Un raport a sugerat că 5hmC poate fi transformat în citosină de către ADN metiltransferazele . Deaminarea 5hmC produce 5-hidroximetiluracil , care poate fi eliminat de enzimele de reparare prin excizia bazei, inclusiv timina ADN-glicozilază (TDG) și ADN-glicozilază monofuncțională selectivă pentru un singur catenar de uracil (SMUG1) . Cu toate acestea, nu se cunoaște în prezent cât de eficient este operațională o astfel de cale in vivo. Oxidarea etapizată a 5hmC de către proteinele TET produce 5-formilcitozină (5fC) și apoi 5-carboxilcitozină (5caC) . Această 5caC, care poate fi detectată la niveluri scăzute în ADN, poate fi apoi eliminată fie prin repararea prin excizia bazei, catalizată de activitatea de ADN-glicozilază a proteinei TDG , fie prin decarboxilare. Teoretic, calea de decarboxilare ar trebui să fie favorabilă, deoarece nu necesită ruperea legăturilor fosfodiesterice ale ADN-ului, care are loc în timpul reparației prin excizie de bază inițiată de TDG. Cu toate acestea, până în prezent, nu a fost identificată nicio activitate enzimatică pentru etapa de decarboxilare, deși decarboxilarea pare să aibă loc .

Multe țesuturi acumulează niveluri destul de substanțiale de 5hmC, mult mai mari decât ar fi de așteptat dacă această bază ar fi pur și simplu un intermediar tranzitoriu într-o cale de oxidare secvențială care duce spre demetilarea ADN-ului. Prin urmare, 5hmC poate fi un modul epigenetic care are propriile sale proprietăți unice de codificare biochimică. Această funcție poate fi una negativă sau de respingere, deoarece oxidarea grupării metil în timpul producerii 5hmC va bloca legarea proteinelor care altfel ar interacționa cu 5mC . Alternativ, funcția sa poate fi una pozitivă sau instructivă dacă există proteine care se leagă în mod specific de 5hmC. Până în prezent, mai multe proteine diferite au demonstrat capacitatea de a recunoaște 5hmC, cel puțin in vitro, inclusiv UHRF1 , MBD3 , MeCP2 și alte câteva identificate printr-o abordare proteomică . Cu toate acestea, rolul biologic al legării lor la 5hmC nu este încă pe deplin clar. Cele mai multe dintre aceste proteine au și alte funcții și, prin urmare, este posibil să nu fie concepute în mod unic pentru a interacționa cu 5hmC.

Rolul 5-hidroximetilcitozinei în dezvoltarea și diferențierea mamiferelor

Rolul funcțional al 5hmC în genomurile mamiferelor este încă neclar. La începutul ciclului de viață al mamiferelor, la fertilizarea ovocitelor de către spermatozoizi, cea mai mare parte din 5mC din genomul patern (derivat din spermă) se oxidează pentru a forma 5hmC . Această etapă de oxidare, despre care anterior se credea că reflectă o adevărată „demetilare” a ADN-ului , este specifică genomului patern, în timp ce genomul matern (derivat din ovocite) rămâne protejat de oxidarea catalizată de Tet . Oxidarea genomului patern este catalizată de Tet3, codificată de singura genă Tet exprimată la niveluri substanțiale în ovocite și zigoți . Eliminarea genetică a lui Tet3 la șoareci duce la eșecul oxidării genomului patern, la compromiterea dezvoltării și la letalitate perinatală .

O altă tranziție importantă de dezvoltare implică demetilarea globală a ADN-ului în celulele germinale primordiale (PGC), care începe în jurul zilei embrionare 8,5-9,5 și se termină în apropierea zilei embrionare 13,5. Mecanismele de ștergere a metilării în PGCs au rămas în mare parte neclare și controversate. S-a presupus de mult timp că demetilarea activă a ADN-ului, independentă de replicare, este o cale cheie probabil implicată în această etapă . Cu toate acestea, date mai recente favorizează o pierdere pasivă de metilare cauzată de lipsa menținerii metilării în timpul replicării ADN-ului . Această pierdere pasivă de 5mC poate fi inițiată efectiv prin conversia 5mC în 5hmC . Tet1 și Tet2 sunt oxidazele 5mC cele mai puternic exprimate în PGC-uri în acest stadiu . Descendenții șoarecilor cu deficit de Tet1 și Tet2 prezintă deficiențe în demethylation ADN la nivelul genelor imprimate . Cu toate acestea, animalele cu deficit de Tet1/2 de ambele sexe au fost fertile, femelele având ovare mai mici și fertilitate redusă. Deleția lui Tet1 și Tet2 poate produce adulți viabili, deși majoritatea acestor șoareci mor în timpul embriogenezei sau în jurul nașterii și prezintă diverse defecte de dezvoltare . Datele sugerează că oxidarea 5mC indusă de Tet1/2 în PGC-uri nu este absolut necesară pentru a produce urmași viabili. Informațiile disponibile în prezent cu privire la demetilarea ADN-ului în zigoți și în PGC-uri nu dispun încă de o analiză mai specifică a 5hmC la nivelul secvenței ADN, așa cum se poate realiza, de exemplu, prin secvențierea TAB . Este de așteptat ca astfel de informații să clarifice implicarea globală sau specifică locusului de formare a 5hmC în inițierea demetilării pasive (sau active) a ADN-ului. Implicarea anterioară a proceselor de reparare prin excizie de bază în reprogramarea liniei germinale , care, prin ea însăși, ar reprezenta un risc enorm pentru menținerea integrității genomului dacă ar funcționa la nivel global, poate avea diverse alte explicații. Într-un scenariu, apariția activității de reparare prin excizia bazei ar putea fi explicată prin cerința de a contracara reacțiile de oxidare false, fără țintă, catalizate de activitatea oxidazei Tet asupra guaninelor din situsurile CpG metilate (guanina fiind baza ADN cea mai susceptibilă la oxidare). Într-un alt context, 5hmC poate fi oxidat în continuare, poate la secvențe specifice, de către proteinele Tet pentru a forma 5caC, care este apoi eliminat prin repararea prin excizie de bază inițiată de TDG .

Pentru că 5hmC este cel mai abundent în țesutul cerebral, a devenit o prioritate să se înțeleagă funcția acestei baze modificate în creier. De exemplu, în ADN din cortexul creierului uman, nivelul de 5hmC este de aproximativ 1% din toate citozinele sau de 20 până la 25% din toate bazele 5mC . Acest lucru corespunde la aproximativ 6.000.000 de baze 5hmC per genom haploid. În mod clar, aceste niveluri sugerează că 5hmC are un rol funcțional important în creierul mamiferelor. Studiile raportate până în prezent au arătat că 5hmC în țesuturile cerebrale este foarte abundent în regiunile genice, fie la nivelul promotorilor, fie chiar mai mult în regiunile intragenice, așa-numitele corpuri genice . Este posibil ca formarea de 5hmC la nivelul promotorilor, al insulelor CpG sau al malurilor (marginilor) insulelor CpG să funcționeze în mod analog cu un proces de reparare pentru a oxida și, în cele din urmă, pentru a elimina 5mC-urile introduse în mod necorespunzător în aceste regiuni . Depunerea de 5hmC în promotori sau în corpurile genice se corelează adesea în mod pozitiv cu activitatea genei. Mecanismul prin care 5hmC asociat corpului genic crește nivelul de transcriere este în prezent necunoscut. O posibilitate este ca oxidarea 5mC să elibereze un efect represiv asupra transcripției, poate prin contracararea transcripției antisens intragenice false. Alte explicații pot include faptul că 5hmC are un efect destabilizator asupra structurii ADN-ului care potențial favorizează deschiderea dublei helixuri de către aparatul de transcripție.

5hmC, deși nu este recunoscut de mai multe proteine de legare a metil-CpG, inclusiv MBD1, MBD2 și MBD4 , este capabil să se lege de MeCP2 , o proteină de legare a metil-CpG care este abundentă în creier și care este mutantă în tulburarea neurologică sindromul Rett . Studii anterioare, utilizând domeniul de legare a metil-CpG (MBD) al MeCP2 mai degrabă decât proteina în întregime, nu au ajuns la concluzia că MeCP2 se leagă de 5hmC . Motivele pentru aceste discrepanțe nu sunt clare. Legătura dintre MeCP2 și 5hmC în creier prezintă un interes deosebit, deoarece nivelurile de 5hmC sunt cele mai ridicate în creier, iar MeCP2 este o proteină abundentă în creier, atingând niveluri similare cu cele ale histonei H1. Din aceste motive, se poate anticipa un rol mecanicist al legării 5hmC de către MeCP2 în creier, mai degrabă la nivelul întregului genom decât la nivelul unei secvențe specifice.

După cum s-a arătat recent, formarea 5hmC este esențială pentru dezvoltarea creierului. Baza este abundentă în neuronii în curs de dezvoltare, în care nivelul său crește în raport cu celulele progenitoare neuronale și unde se localizează în mod specific la corpurile genice ale genelor importante pentru diferențierea neuronală . Tet3 este cel mai puternic exprimat în cortexul creierului de șoarece în curs de dezvoltare, urmat de Tet2, iar nivelurile lui Tet1 sunt foarte scăzute în acest țesut. O creștere a nivelurilor de Tet2, Tet3 și 5hmC în neuronii în curs de diferențiere coincide cu o reducere a metiltransferazei Polycomb H3K27 Ezh2 și cu pierderea H3K27me3 în genele critice. Reducerea nivelurilor de Tet2 și Tet3 sau creșterea expresiei Ezh2 duce la o diferențiere neuronală incompletă sau blocată . Astfel, formarea de 5hmC promovează diferențierea neuronală prin modularea expresiei genelor cele mai critice în această importantă tranziție de dezvoltare.

Pierderea de 5-hidroximetilcitozină în cancer

Nivelurile de 5hmC în cancer sunt puternic reduse în raport cu țesutul normal corespunzător din jurul tumorii . Utilizând cromatografie lichidă-spectrometrie de masă, imunodot blot pe bază de anticorpi anti-5hmC și imunohistochimie, am demonstrat pierderea de 5hmC asociată cu tumorile pentru cancerele de plămân, creier, sân, ficat, rinichi, prostată, intestin, uter și melanom . Alți cercetători au confirmat această observație prin evidențierea pierderii de 5hmC în diferite tipuri de tumori solide . Mai mult, s-a demonstrat că reintroducerea TET2 restabilește nivelurile de 5hmC și scade potențialul metastatic al celulelor de melanom . În mod surprinzător, atunci când am co-inmunocolorat secțiuni de țesut cu anticorpi împotriva 5hmC și împotriva antigenului Ki67, care este un marker care se găsește numai în celulele proliferante, am observat că 5hmC și Ki67 nu sunt aproape niciodată prezente simultan într-o singură celulă . La nivel de diagnostic clinic, analiza imunohistochimică combinată a pierderii 5hmC și a prezenței celulelor Ki67-pozitive ar putea fi dezvoltată într-un biomarker pentru diagnosticarea cancerului. Lipsa sau reducerea puternică a 5hmC în tumori sugerează că celulele proliferante pierd 5hmC. În cele mai multe cazuri, cea mai mare parte a masei tumorale este sărăcită de 5hmC chiar și atunci când celulele Ki67-pozitive sunt rare, ceea ce sugerează că aceste celule tumorale au avut în trecut un istoric de proliferare care a dus la pierderea de 5hmC, care nu este apoi restabilită . Pierderea de 5hmC dependentă de replicare reflectă o situație care amintește de cea de la embrionii preimplantați, în care formarea inițială de 5hmC în ADN-ul patern este urmată de pierderea sau diluarea dependentă de replicare a acestei mărci . În mod similar, conținutul global de 5hmC scade rapid pe măsură ce celulele din țesuturi normale se adaptează la cultura celulară . Cea mai simplă explicație este că oxidarea 5mC produce un situs CpG hemi-hidroximetilat în ADN care nu este recunoscut de DNMT1 în timpul replicării ADN. O astfel de explicație este în concordanță cu studiile in vitro care arată că DNMT1 este incapabil să opereze pe situsurile CpG care conțin 5hmC . Cu toate acestea, sunt posibile și alte explicații pentru reducerea 5hmC în cancer. Este posibil ca nivelul proteinelor TET să fie mai scăzut în țesutul tumoral decât în omologul său normal corespunzător. Deși nu am observat diferențe consistente la nivel de ARN pentru TET1, TET2 sau TET3 în tumorile pulmonare și cerebrale în raport cu țesutul normal , alții au raportat niveluri mai scăzute de expresie a genei TET în cancer . O posibilitate suplimentară este aceea că celulele canceroase conțin căi metabolice compromise care sunt implicate în producerea cofactorului pentru activitatea TET, 2-oxoglutaratul (a se vedea mai jos).

Mutația TET2 în cancerul uman

TET1 aparține unei familii de proteine caracterizate ca promovând conversia 5mC în 5hmC în ADN-ul mamiferelor . Există trei membri identificați aparținând familiei TET: TET1, TET2 și TET3. TET1 este localizată pe cromozomul uman 10q21.3, în timp ce TET2 este localizată pe cromozomul 4q24, iar TET3 este localizată pe cromozomul 2p13.1. Enzima TET1 este alcătuită dintr-un domeniu de legare a ADN-ului CXXC cu deget de zinc, o regiune bogată în cisteină și un domeniu de dioxigenază dependentă de 2-oxoglutarat și fier (II) (2OGFeDO). TET3 conține, de asemenea, un domeniu CXXC N-terminal . Cu toate acestea, gena TET2 a suferit o inversiune genetică cromozomială în timpul evoluției, separând astfel domeniul său CXXC de domeniul catalitic și creând o nouă genă cu domeniu CXXC numită IDAX/CXXC4, care codifică un regulator negativ al TET2 . Pe baza profilelor EST și a rețelelor de expresie, TET1 prezintă cea mai mare expresie în timpul embriogenezei și nu prezintă o expresie relevantă în țesuturile adulte. TET2 se exprimă mai ales în celulele hematopoietice, iar TET3 pare să se exprime omniprezent în țesuturile umane adulte.

Leucemia este o boală în care, în timpul diferențierii normale a celulelor stem hematopoietice, expansiunea clonală a celulelor precursoare hematopoietice din măduva osoasă este afectată într-un anumit stadiu de diferențiere, provocând un dezechilibru între diferențiere și auto-reînnoire. Expansiunea necorespunzătoare a celulelor progenitoare hematopoietice este cauzată în primul rând de un blocaj al maturării celulare. Tulburările sindromului mielodisplastic (MDS) în hematopoieză se caracterizează prin citopenie (număr scăzut de celule sanguine), hematopoieză ineficientă într-o linie celulară sau alta și un risc crescut de transformare în leucemie mieloidă acută (LMA) . În cazul LMA, creșterea rapidă a globulelor albe anormale în măduva osoasă duce la un blocaj în producția de diverse celule din alte linii celulare.

TET2 a fost găsită mutantă la pacienții cu neoplasme mieloproliferative (MPN), MDS, AML și leucemie mielomonocitară cronică (CMML), și este cea mai frecventă genă mutantă în MDS . Mutațiile TET1 sau TET3 nu sunt observate în MDS și nici mutația TET2 nu se corelează cu alte câteva mutații comune cunoscute . În mod interesant, mutațiile isocitrat dehidrogenazei 1/2 (IDH1/2) sunt rareori întâlnite împreună cu mutațiile TET2, dar au efecte similare cu cele ale mutațiilor TET2 asupra celulelor stem hematopoietice (HSC) . În timp ce mutațiile TET2 sunt asociate cu o supraviețuire generală redusă în LMA în comparație cu pacienții cu TET2 de tip sălbatic, mutațiile TET2 la pacienții cu MDS și MPN favorizează progresia spre LMA . Gena TET2 este alcătuită dintr-un total de unsprezece exoni, care se traduc într-un produs proteic de 2002 aminoacizi . Mutațiile TET2 în cancerele mieloide au fost observate cel mai frecvent în exonii 3a și 10, care sunt cei mai lungi exoni . Atât celulele progenitoare multipotente, cât și cele angajate în linia hematopoietică sunt vizate de mutațiile TET2 în MPN, ceea ce implică faptul că TET2 joacă un rol important în mielopoieză . Delețiile TET2 și pierderea heterozigozității sau disomia uni-parentală au fost observate la (9%) pacienți cu MDS/AML cu TET2 mutant, unde este probabil ca alela de tip sălbatic să fie pierdută în timpul recombinării, permițând TET2 mutant să promoveze un fenotip de pierdere a funcției. Kosmider et al. au observat că 50 % dintre pacienții cu TET2 mutantă aveau defecte genetice care vizau cele două copii TET2. Mutațiile în TET2 par să ducă la pierderea funcției, sugerând că ar putea juca un rol de supresie tumorală.

Înțelegerea implicațiilor care stau la baza lipsei de funcție a TET2 mutant și a rolului său în malignitățile mieloide este o prioritate actuală de cercetare. Mai multe laboratoare au generat modele condiționate de șoareci Tet2 knock-out în care au fost vizați exoni critici ai Tet2. Moran-Crusio et al. au observat că șoarecii Tet 2-/-/ au dezvoltat splenomegalie la vârsta de 20 de săptămâni, prezentând fenotipuri similare cu cele observate la pacienții umani cu CMML cu TET2 mutant. Datele de la diferitele modele de șoareci au condus la observații similare. Ștergerea Tet2 nu este letală din punct de vedere embrionar. O observație majoră făcută de Moran-Crusio et al. și de Ko et al. este aceea că celulele stem hematopoietice de la șoarecii Tet2-/- au o capacitate crescută de repopulare a compartimentului hematopoietic in vivo în timpul testelor de reconstituire competitivă cu concurență din partea CSH provenite din celule Tet2+/+. Analiza diferitelor organe ale șoarecilor Tet2-/- a arătat că pierderea Tet2 nu este compensată de o creștere a expresiei Tet1 sau Tet3 . Nivelurile de 5hmC sunt semnificativ scăzute în măduva osoasă și splina șoarecilor Tet2-/- . Șoarecii Tet2-/- prezintă o creștere a celulelor HSC, cu o ușoară creștere a progenitorilor mieloizi, înclinând hematopoieza spre sorți de celule monocite/macrofage . Se sugerează că un Tet2 activ ar regla hematopoieza normală pentru a asigura o distribuție adecvată a liniilor și o diferențiere controlată a CSH. De un interes deosebit este efectul mutațiilor TET2 asupra nivelurilor și modelelor de 5mC în genom. Cu toate acestea, datele actuale sunt departe de a fi clare. În timp ce un raport a indicat că mutația TET2 în LMA este asociată cu un fenotip de hipermetilare a ADN-ului , alte date au sugerat că probele de măduvă osoasă de la pacienții cu mutații TET2 au niveluri scăzute de 5hmC și hipometilare a ADN-ului . Situația este complicată de faptul că tumorile maligne hematopoietice sunt adesea caracterizate de mutații în mai mulți modificatori epigenetici, inclusiv EZH2, IDH1, IDH2, MLL, DNMT3A și ASXL1, ceea ce ar putea întuneca orice asociere directă . De exemplu, într-un studiu, opt din unsprezece pacienți cu mutații DNMT3A (73%) în limfomul cu celule T prezentau, de asemenea, mutații TET2 .

Mutații în căile de cofactori

5mC oxidazele sunt enzime dependente de 2-oxoglutarat (Figura 2). Acest cofactor este produs în ciclul acidului tricarboxilic din izocitrat de către enzima IDH. Este interesant faptul că mai multe tipuri de tumori umane conțin mutații în gena IDH1. Mutațiile IDH1 sunt deosebit de frecvente în gliomii de gradele II și III, unde se găsesc la până la 70% dintre pacienți . Mutațiile în IDH1 și IDH2 sunt, de asemenea, observate în leucemiile mieloide și în alte câteva tumori maligne, dar cu o frecvență mai mică . Aceste mutații IDH1 nu sunt împrăștiate în toată gena, ci se găsesc aproape exclusiv la poziția 132 a aminoacidului. Această constatare sugerează că această proteină mutantă IDH1 particulară are o proprietate de câștig de funcție. O descoperire surprinzătoare a fost aceea că mutantul IDH1 codon 132 de la arginină la histidină produce ca produs de reacție oncometabolitul 2-hidroxiglutarat (2HG) în loc de 2-oxoglutarat . Se pare că reacția de oxidare a izocitratului efectuată de acest mutant este incompletă și produce doar 2HG. În plus, 2HG este un inhibitor competitiv al multor activități enzimatice dependente de 2-oxoglutarat, dacă nu chiar al tuturor. Proteinele TET reprezintă o clasă de astfel de enzime și s-a demonstrat că 2HG este un inhibitor al TET1 și TET2.

O corelație interesantă a faptului că IDH1 a suferit o mutație în tumorile de gliom este că tumorile mutante IDH1 sunt aproape întotdeauna asociate cu modificări abundente la nivelul genomului în ceea ce privește metilarea ADN-ului, după cum indică hipermetilarea generalizată a insulelor CpG . Acest fenotip a fost denumit fenotipul metilator al insulelor CpG (sau CIMP) . Este tentant să presupunem că CIMP în glioamele cu mutație IDH1 este legat de un eșec al producției de 5hmC în aceste tumori, deoarece activitatea TET este compromisă de 2HG. De fapt, introducerea experimentală a unei construcții mutante IDH1 în astrocite umane a dus la apariția unui fenotip asemănător CIMP . Mai mult, la șoarecii knock-in condiționali la care cel mai comun mutant Idh1 R132H a fost inserat în locusul Idh1 endogen și a fost exprimat în celulele hematopoietice, s-a observat hipermetilarea ADN-ului . Cu toate acestea, într-o comparație directă a nivelurilor de 5hmC în ADN între glioamele IDH1 mutante și glioamele IDH1 de tip sălbatic, nu am observat nicio diferență substanțială între aceste două categorii de tumori cerebrale . Prin urmare, trebuie să se țină cont de faptul că IDH1 mutant și produsul său metabolit 2HG nu afectează doar enzimele TET, ci și inhibă multe demetilaze de lizină care depind de 2-oxoglutarat și de alte enzime dependente de 2-oxoglutarat. Disfuncția acestor demetilaze de lizină poate avea un impact secundar asupra modelelor de metilare a ADN-ului la nivelul insulelor CpG.

.