ABT-263: Un inhibitor puternic și biodisponibil pe cale orală al familiei Bcl-2

Rezultate

ABT-263 este un inhibitor al familiei Bcl-2 biodisponibil pe cale orală. Caracteristicile structurale ale ABT-737 care conferă proprietăți medicamentoase nedorite rezultă din elemente de proiectare esențiale pentru inhibarea unei suprafețe mari, a interacțiunii hidrofobe proteină-proteină și reducerea legăturii cu seroalbumina (4-6). Pentru a îmbunătăți eficacitatea orală a acestei molecule relativ mari (MW >800), a fost necesar un echilibru atent între afinitatea cu ținta, potența celulară și absorbția orală. Au fost identificate trei situsuri-cheie de-a lungul coloanei vertebrale a ABT-737 care afectează echilibrul de sarcină, metabolismul și absorbția orală (Fig. 1). Analogii care încorporează modificări în aceste poziții au fost optimizați pentru a maximiza relația farmacocinetică/farmacodinamică între expunerea orală la animale și eficacitatea în liniile celulare tumorale umane. Aceste eforturi au dus la identificarea ABT-263.

ABT-263 menține o afinitate ridicată pentru Bcl-xL, Bcl-2 și Bcl-w, care se situează sub limita de detecție a testului de polarizare a fluorescenței (Ki ≤1 nmol/L), dar se leagă mai slab de Mcl-1 și A1 (tabelul 1). Acest model de selectivitate este similar cu cel al predecesorului său ABT-737 și al proteinei Bad, care conține numai BH3 (12). Afinitatea subnanomolară a ABT-263 pentru Bcl-xL a fost confirmată de un test mai sensibil de transfer de energie prin rezonanță de fluorescență cu rezonanță în timp, care arată că enantiomerul (un stereoizomer cu configurația opusă a grupului morfolinoetil, utilizat ca un control mai puțin activ) este de ∼40 de ori mai puțin puternic.

Profilul farmacocinetic al ABT-263 se caracterizează prin valori scăzute ale clearance-ului plasmatic și volume mici de distribuție la șoarece, șobolan, câine și maimuță, cu timpi de înjumătățire plasmatică de eliminare după doza i.v. de 4,6 până la 8,4 ore (tabelul suplimentar S1). Biodisponibilitatea după gavare orală a fost de ∼20% la toate cele patru specii. Din cauza solubilității sale apoase scăzute, ABT-263 prezintă o absorbție orală limitată de rata de dizolvare prelungită. Administrarea p.o. în formulări pe bază de lipide, în care compusul este semnificativ mai solubil, determină o absorbție îmbunătățită, cu o biodisponibilitate de aproape 50% și un timp de înjumătățire prin eliminare orală de 8,9 ore la câini. O curbă reprezentativă a concentrației plasmatice a medicamentului după administrarea i.v. sau p.o. la câine este prezentată în figura suplimentară S1.

ABT-263 prezintă citotoxicitate bazată pe mecanism. Un număr de molecule mici mimetice BH3 au fost raportate că se leagă de membrii familiei Bcl-2 cu afinitate modestă și induc apoptoza în liniile celulare tumorale (21-23). Cu toate acestea, s-a demonstrat recent că mulți dintre acești agenți ucid celulele într-un mod independent de Bax/Bak, punând sub semnul întrebării relevanța funcțională a afinității lor slabe pentru proteinele Bcl-2 și adevăratele mecanisme de acțiune ale acestor molecule (14). Prin urmare, am considerat că este important să demonstrăm în mod robust că apoptoza indusă de ABT-263 a fost rezultatul direct al inhibării proteinelor din familia Bcl-2. În primul rând, activitatea celulară a ABT-263 a fost evaluată în linia celulară murină FL5.12 prolimfocitară dependentă de interleukina-3 (IL-3). Retragerea IL-3 induce apoptoza FL5.12, în parte prin reglarea în sus a factorilor proapoptotici Bim și Puma (24, 25). Supraexprimarea Bcl-2 (FL5.12-Bcl-2) sau Bcl-xL (FL5.12-Bcl-xL) protejează împotriva efectelor retragerii IL-3 prin sechestrarea lui Bim și Puma (25). ABT-263, dar nu și enantiomerul, a inversat protecția oferită de supraexpresia de Bcl-2 sau Bcl-xL (EC50 = 60 și, respectiv, 20 nmol/L; Fig. 2A). ABT-263 a fost ineficient în declanșarea morții celulare în prezența IL-3, în cazul în care celulele FL5.12 nu au fost supuse unor stimuli proapoptotici. Capacitatea ABT-263 de a ucide celulele FL5.12-Bcl-2 sau FL5.12-Bcl-xL în condiții de retragere a IL-3 a fost semnificativ atenuată în prezența inhibitorului de caspază ZVAD, ceea ce indică faptul că uciderea celulelor este dependentă de caspază (Fig. Suplimentară S2).

Pentru a determina dacă citotoxicitatea indusă de ABT-263 poate fi atribuită întreruperii interacțiunilor intracelulare între proteinele-proteine din familia Bcl-2, s-au efectuat studii de coimunoprecipitare. ABT-263 a indus o scădere dependentă de doză a interacțiunilor Bim:Bcl-xL în decurs de 2 ore posttratament în celulele FL5.12-Bcl-xL (Fig. suplimentară S3). Modele similare au fost, de asemenea, observate pentru întreruperea complexelor Bim:Bcl-2 în celulele FL5.12-Bcl-2 (datele nu sunt prezentate), ceea ce indică faptul că ABT-263 restabilește moartea celulară dependentă de IL-3 prin atenuarea capacității lui Bcl-xL și Bcl-2 de a sechestra factorii proapoptotici, cum ar fi Bim. Capacitatea ABT-263 de a întrerupe interacțiunile dintre proteinele-proteine din familia Bcl-2 a fost confirmată într-un sistem bi-hibrid de mamifere (Fig. 2B). ABT-263 a inhibat interacțiunea VP16-Bcl-xS cu Gal4-Bcl-xL (EC50 aparentă ∼50 nmol/L), în timp ce enantiomerul a fost mult mai puțin eficient.

Pentru a interoga în continuare mecanismul de acțiune, activitatea ABT-263 a fost evaluată într-o serie de celule de fibroblaste embrionare de șoarece (MEF) care au inclus celule de tip sălbatic (WT), precum și celule deficitare în Bcl-x, Mcl-1 și Bax/Bak (DKO). ABT-263 a indus puternic moartea celulară în celulele MEF Mcl-1-/-/- (EC50 ∼50 nmol/L), dar nu și în celulele MEF Bcl-x-/-/- (EC50 ≥10 μmol/L) (Fig. Suplimentară S4A). Acest lucru confirmă capacitatea ABT-263 de a inhiba funcțional Bcl-xL, dar nu și Mcl-1, într-un context celular și este în concordanță cu observațiile anterioare cu ABT-737 (7, 11, 13, 14, 26). Enantiomerul a fost ineficient în ambele sisteme. ABT-263 a fost, de asemenea, ineficient (EC50 ≥10 μmol/L) în uciderea celulelor MEF WT sau DKO, în concordanță cu rapoartele anterioare (14). În schimb, etopozidul, un agent citotoxic general, precum și două mimetice BH3 cu moleculă mică raportate , au indus moartea celulară cu EC50-uri similare în toate cele patru tipuri de celule MEF, sugerând că acești compuși induc moartea celulară, cel puțin în parte, prin mecanisme independente de familia Bcl-2 (Fig. Suplimentară. S4C).

Pentru a evalua capacitatea ABT-263 de a induce direct apoptoza într-o linie celulară tumorală umană, translocarea Bax și eliberarea de citocrom c au fost monitorizate în linia celulară SCLC H146. S-a demonstrat că H146 este dependentă de Bcl-2 pentru supraviețuire (25). ABT-263 a indus o scădere dependentă de doză a Bax citosolic cuplat cu o creștere a citocromului c citosolic în decurs de 2 ore după tratament (Fig. 2C-i). Enantiomerul nu a fost în măsură să determine un răspuns similar. Activarea Bax și eliberarea de citocrom c au fost confirmate prin microscopie (Fig. 2C-ii). Anticorpul anti-Bax 6A7, care recunoaște în mod specific forma conformațional activă a Bax, a fost utilizat pentru a detecta Bax activat în celulele H146. În concordanță cu studiile de fracționare, tratamentul cu ABT-263 a fost asociat cu o creștere substanțială a Bax activat. Acest lucru a corespuns eliberării citocromului c din mitocondrii în citosol, după cum reiese din scăderea structurilor punctate și creșterea colorării citosolice. ABT-263, dar nu și enantiomerul său, a indus, de asemenea, o creștere dependentă de timp a activității caspazei-3 care a fost detectabilă la 2 ore și care a atins un vârf la ∼6 ore (Fig. 2D). Acest efect a fost dependent de concentrație, cu o EC50 ∼100 nmol/L la punctul de timp de 6 ore (Fig. 2D, inset). În schimb, camptotecina, un inhibitor al topoizomerazei I despre care s-a raportat că induce apoptoza mitocondrială și activarea ulterioară a caspazelor (27, 28), a fost capabilă să provoace o creștere a activității caspazei-3 doar după 24 de ore (datele nu sunt prezentate). Aceste date indică faptul că ABT-263 acționează direct pentru a inhiba Bcl-2 și Bcl-xL, eliberând factori proapoptotici, cum ar fi Bim, pentru a induce o activare rapidă a căii apoptotice mitocondriale.

Pentru a evalua amploarea activității celulare a ABT-263, a fost examinat un panel de linii celulare tumorale umane care acoperă o gamă de tipuri de tumori. În concordanță cu rapoartele anterioare privind ABT-737 (12), ABT-263 a prezentat activitate ca agent unic în SCLC și în tumorile hematologice maligne, dar nu și în majoritatea celorlalte tipuri de tumori (datele nu sunt prezentate). Pentru a investiga mai îndeaproape activitatea în cadrul acestor tipuri de tumori sensibile, ABT-263 a fost examinat în panouri de linii celulare derivate din SCLC (n = 22) și tumori hematologice maligne (n = 23). În fiecare panel, ABT-263 a prezentat o gamă de potență, 32% (SCLC) și 48% (hematologice) din liniile celulare fiind foarte sensibile (EC50 <1 μmol/L; Fig. 3). Enantiomerul a fost >20 de ori mai puțin activ în aceste celule sensibile (tabelul suplimentar S2).

Dosarea orală de ABT-263 determină regresia tumorilor xenogrefe SCLC și ALL in vivo. Pentru a extinde aceste observații in vivo, ABT-263 a fost evaluat în modele de xenogrefe de flanc stabilite din unele dintre liniile celulare sensibile de SCLC și hematologice. Atunci când a fost administrat p.o., o dată pe zi, în doză de 100 mg/kg timp de 21 de zile consecutive, ABT-263 a indus răspunsuri tumorale rapide și complete (CR) care au fost durabile timp de câteva săptămâni după terminarea tratamentului la toate animalele purtătoare de tumori H889 (SCLC) sau RS4;11 (ALL) (Fig. 4A). Un tratament similar al șoarecilor purtători de tumori H146 SCLC a indus regresii rapide, rezultând CR la 60% și PR la 40% dintre animale (Fig. 4A). La acest model s-a observat o revenire treptată a tumorii începând cu câteva săptămâni după terminarea tratamentului. Activitatea a fost dependentă de doză în modelul de xenogrefă H146. Tratamentul cu ABT-263 la 50 mg/kg timp de 21 de zile consecutive a indus RC la 22 % și RP la 44 % dintre animale, în timp ce 25 mg/kg a indus o inhibiție semnificativă din punct de vedere statistic, dar modestă, a creșterii tumorale, fără a se observa regresii tumorale. ABT-263 a fost bine tolerat (<5% pierdere în greutate) la toate dozele.

Pentru a corela expunerea la ABT-263 cu eficacitatea antitumorală, a fost realizat un studiu farmacocinetic în stare de echilibru în care șoarecii purtători de tumori au fost administrați p.o. o dată pe zi timp de 3 zile, iar concentrațiile plasmatice ale medicamentului au fost determinate după a treia doză. Atât concentrația plasmatică maximă (Cmax), cât și aria sub curba concentrației plasmatice (AUC) au fost proporționale cu doza și au crescut într-un mod aproximativ liniar (tabelul suplimentar S3). O doză de 100 mg/kg, care a produs o rată de răspuns global de 100 % (rata de răspuns global = CR + PR), a dat valori Cmax și AUC de 7,7 μmol/L și, respectiv, 90 μmol/L h. Expunerea rezultată în urma administrării unei doze de 50 mg/kg, care a determinat o rată de răspuns global de 66%, a fost de 5,4 μmol/L (Cmax) și 54 μmol/L h (AUC). Aceste date indică faptul că concentrațiile plasmatice maxime ale medicamentului ABT-263 cuprinse între ∼5,4 și 7,7 μmol/L sunt foarte eficiente.

ABT-263 sporește activitatea agenților chimioterapeutici in vivo. Eficacitatea in vivo a ABT-263 a fost investigată în combinație cu agenți terapeutici utilizați în mod obișnuit în mai multe modele agresive de tumori hematologice maligne. ABT-263 și rituximab au fost examinate în modelul de xenogrefă de flanc de limfom cu celule B DoHH2 (Fig. 4B). Atunci când a fost administrat zilnic la 100 mg/kg p.o. timp de 17 zile, ABT-263 a prezentat o inhibiție a creșterii tumorale de 44 %. O singură doză de 10 mg/kg de rituximab a determinat o inhibiție a creșterii tumorale de 84 %. Nici ABT-263, nici rituximabul singure nu au obținut o regresie susținută a tumorii; cu toate acestea, combinația a prezentat un efect superior, obținând 70% CR și 10% PR. Această combinație a dus, de asemenea, la o îmbunătățire semnificativă a întârzierii creșterii tumorale (>700%) față de rituximab singur (300%).

Eficacitatea ABT-263 singur și în combinație cu un regim R-CHOP modificat a fost, de asemenea, evaluată într-un model de xenogrefă de flanc GRANTA-519 de limfom cu celule mantale (Fig. 4B). ABT-263 administrat la 100 mg/kg p.o. timp de 21 de zile consecutive a determinat o inhibiție a creșterii tumorale de 40 %. În comparație, regimul R-CHOP a inhibat creșterea tumorii cu 68%, cu o RC de 20%. Combinația a dus la regresii tumorale dramatice și răspunsuri tumorale complete la toate animalele testate, fără semne de recreștere tumorală la patru din nouă tumori evaluabile.

În cele din urmă, am examinat capacitatea ABT-263 de a potența efectele chimioterapiei într-un model rezistent la ABT-263. În modelul de xenogrefă pe flanc OPM-2 de mielom multiplu (EC50 in vitro = 6,7 μmol/L), ABT-263 administrat zilnic timp de 21 de zile la 100 mg/kg nu a inhibat semnificativ creșterea tumorală (Fig. 4B). Bortezomibul administrat la doza sa maximă tolerată (1 mg/kg i.v., qd ×3) a inhibat creșterea tumorii cu 70 %, fără a se înregistra RC. ABT-263 a sporit eficacitatea bortezomibului, combinația având ca rezultat o inhibare a creșterii tumorale de 95% și o rată de RC de 40%.

ABT-263 induce o trombocitopenie rapidă, dar reversibilă. Am raportat recent că ABT-737 induce o trombocitopenie rapidă și reversibilă la animale care rezultă din inhibarea proteinelor din familia Bcl-2 și inducerea apoptozei în trombocitele circulante fără toxicitate asupra măduvei osoase (29). Așa cum era de așteptat, ABT-263 induce, de asemenea, trombocitopenie. După o singură doză p.o. la câini, numărul de trombocite circulante a scăzut în decurs de 2 ore, cu un nadir plachetar la 6 ore și dovezi de revenire în decurs de 24 de ore (Fig. 5A). Pentru a determina efectele administrării prelungite, am examinat relația farmacocinetică/farmacodinamică în urma unor doze zilnice multiple la câine (Fig. 5B). ABT-263 a fost administrat p.o. la o doză de 2 mg/kg/zi timp de 6 zile, apoi a fost crescut la 6 mg/kg/zi timp de încă 6 zile. Numărul de trombocite și concentrațiile plasmatice ale medicamentului au fost evaluate la 6 ore după tratament pentru a surprinde nadirurile plachetare probabile în zilele 1-4 și în zilele 7-11. La 2 mg/kg, numărul de trombocite a scăzut de la o valoare inițială de ∼250.000/μL la ∼125.000/μL până la a doua doză, menținându-se apoi constant pentru celelalte doze. Concentrația plasmatică a medicamentului obținută la 6 ore după tratament (C6h) a rămas constantă la valori cuprinse între 3,6 și 4,2 μmol/L. Pe baza profilului farmacocinetic al ABT-263 (Fig. Suplimentară S1), C6h este de aproximativ 2 ori mai mică decât Cmax, ceea ce indică faptul că concentrațiile plasmatice maxime ale medicamentului obținute după doze multiple de 2 mg/kg sunt de ∼7 până la 8 μmol/L. Aceste niveluri sunt similare cu cele obținute după o doză de 100 mg/kg p.o. la șoareci. Atunci când doza de ABT-263 a fost crescută la 6 mg/kg/d, numărul de trombocite a scăzut la ∼50.000/μL până în a doua zi a acestei doze mai mari și a rămas relativ constant pe durata studiului. Valorile C6h la acest nivel de doză au variat între 10,2 și 14,8 μmol/L (Cmax, 20-30 μmol/L). ABT-263 a fost bine tolerat în acest studiu, fără mortalitate sau semne clinice adverse. Cu toate acestea, unele hematoame au fost evidente la locul puncției venoase, în concordanță cu alterări ale hemostazei. Aceste date indică faptul că expunerea zilnică repetată la ABT-263 la niveluri care s-au dovedit a fi foarte eficiente în modelele murine are ca rezultat o reducere de ∼50% a trombocitelor circulante la câini. Mai mult, concentrații plasmatice de câteva ori mai mari decât nivelul eficace sunt bine tolerate, numărul de trombocite circulante fiind redus la ∼50.000/μL.

.