Biosinteza trans-4-hidroxiprolină de către tulpini recombinante de Corynebacterium glutamicum și Escherichia coli

Construcția de tulpini recombinante producătoare de trans-Hyp

În baza de date există mai multe gene care sunt speculate ca gene putative de L-prolină 4-hidroxilază, inclusiv gene din Pseudomonas stutzeri , Janthinobacterium sp., Bordetella bronchiseptica RB50, Bradyrhizobium japonicum, Achromobacter xylosoxidans C54 și Dactylosporangium. sp. Folosind PCR, am clonat și am obținut genele putative ale P4H din P. stutzer și B. bronchiseptica RB50, denumite p4hP și p4hB. Acestea au fost ligaturate la plasmidele corespunzătoare după digestie și transformate în C. glutamicum și, respectiv, E. coli. Lungimea p4hP a fost de 918 bps, în timp ce p4hB a fost de 924 bps. Aceste secvențe au fost 100% identice cu genele raportate în NCBI. Gena trans-P4H din Dactylosporangium sp. (p4hD) a fost exprimată cu succes în E. coli și poate transforma L-prolina cu proprietăți enzimatice bune. Lungimea p4hD a fost de 816 bps, codificând o polipeptidă de 272 aminoacizi cu o greutate moleculară de 29.715 daltoni. În acest studiu, p4hD a fost aplicat cu unele modificări asupra bazelor nucleare. A fost analizată secvența originală a genei p4hD (http://www.kazusa.or.jp/codon/), iar rezultatele au arătat că existau unii codoni rari atât pentru C. glutamicum, cât și pentru E. coli. S-a raportat că codonii rari sunt puternic asociați cu un nivel scăzut de expresie a proteinei . S-a demonstrat adesea că optimizarea codonilor pentru exprimarea proteinelor heterologe crește drastic expresia proteinelor . Astfel, codonii rari din gena p4hD au fost înlocuiți cu cei utilizați cu frecvență ridicată în C. glutamicum, iar conținutul de GC a fost ajustat de la 73% la 61% prin conversie sinonimică, care a fost aproape de cel din C. glutamicum. Gena modificată a p4hD a fost sintetizată în conformitate cu modificările de mai sus (Fișier suplimentar 1).

Expresia P4H este unul dintre aspectele importante privind construcția căii de biosinteză a trans-Hyp. Figura 2 prezintă SDS-PAGE a trans-P4H-urilor exprimate în C. glutamicum recombinant și E. coli. Toate trans-P4H recombinante au fost exprimate ca proteine solubile, fără corpuri de incluziune. A fost evident că trans-P4H recombinante din E. coli au fost exprimate mult mai mult decât cele din C. glutamicum (figura 2). Mulți factori influențează exprimarea proteinelor străine, inclusiv promotorii, sistemul gazdă-vector și condițiile de cultură etc. . Deoarece a fost prima exprimare a trans-P4Hs în C. glutamicum, în activitatea noastră viitoare se vor lua în considerare studii mai cuprinzătoare, cum ar fi selectarea promotorilor și optimizarea condițiilor de cultură.

Compararea activităților P4H

Oxigenazele sunt aplicate pe scară largă în industrie, deoarece pot cataliza oxifuncționalizarea extrem de specifică a legăturilor C-H neactivate în condiții blânde, în special transferând oxigenul molecular către un substrat . P4H aparține unei familii de dioxigenază dependentă de 2-oxoacizi, care este o proteină monomerică și utilizează mai degrabă substraturile monomerice decât cele polimerice . În acest studiu au fost măsurate activitățile trans-P4H-urilor care utilizează celule întregi recombinante (tabelul 1). Datele noastre au indicat că nivelul proteinei exprimate și activitatea enzimatică a fost mai mare la 30°C. Rezultatele au arătat, de asemenea, că plasmidele au fost foarte stabile, deoarece stabilitățile plasmidice ale tulpinilor recombinate de E. coli și C. glutamicum au fost toate mai mari de 98% la sfârșitul fermentației.

Celele recombinante care exprimă gene diferite au prezentat niveluri diferite de activități catalitice față de L-prolină. Activitatea trans-P4H exprimată de E. coli BL21/ pET28a-p4hD a fost cea mai mare dintre toate tulpinile recombinante construite. Noile gene clonate și exprimate din P. stutzeri și B. bronchiseptica au prezentat, de asemenea, activități interesante. În ceea ce privește diferitele tulpini gazdă, E. coli a fost mai bine reprezentată decât C. glutamicum, ceea ce poate fi legat de performanța plasmidului corespunzător. Patru tulpini producătoare de L-prolină din C. glutamicum au fost utilizate ca tulpini gazdă de expresie, iar tulpinile recombinante rezultate au prezentat activități enzimatice diferite. Cea mai mare activitate enzimatică specifică dintre tulpinile de C. glutamicum a fost de 40,7 U/mg – celulă umedă de către C. glutamicum ATCC13032/pEC-XK99E-p4hB. Cu toate acestea, activitatea enzimatică specifică a E. coli/pET28a -p4hD recombinant a fost de până la 60,4 U/mg – celulă umedă. Creșterea celor trei tulpini de E. coli recombinant a fost similară. Dar a existat o diferență semnificativă între tulpinile recombinate de C. glutamicum. Tulpinile de C. glutamicum recombinant cu activități enzimatice specifice mai mari au crescut mai puțin decât cele cu activități enzimatice specifice mai mici. În plus, activitatea enzimatică a E. coli BL21 /pET28a -p4hD a fost similară cu cea a E. coli W1485/pWFH1 și mai mare decât cea a E. coli BL21/pET24-p4h1 din . P4hD din E. coli W1485/pWFH1 a fost cea originală din Dactylosporangium sp., în timp ce p4hD din E. coli BL21/pET24-p4h1 a fost modificată. Deși optimizarea codonilor din acest studiu a fost concepută pentru C. glutamicum, rezultatele au indicat că a fost realizată cu succes și în E. coli.

Producția de trans-Hyp în flacoane

Producția de trans-Hyp de către diferite tulpini recombinate de C. glutamicum și E. coli a fost, de asemenea, prezentată în tabelul 1. Producția de trans-Hyp de către aceste tulpini recombinante a depins atât de activitatea enzimatică a P4H, cât și de creșterea celulară. E. coli BL21/ pET28a-p4hD a avut cel mai mare randament, care a coincis cu activitatea sa enzimatică specifică. Deși tulpinile recombinate de E. coli au crescut în mod similar în mediul de producție, a existat o diferență semnificativă în ceea ce privește producția de trans-Hyp, care nu s-a menținut la același nivel cu activitățile enzimatice specifice. Producția de trans-Hyp de către tulpinile recombinate de C. glutamicum a fost, de asemenea, mult mai mică decât cea de E. coli BL21/pET28a-p4hD. Aceasta s-a datorat atât expresiei mai reduse a trans-P4H, cât și creșterii celulare mai reduse la C. glutamicum. Producția de L-prolină a patru tulpini de C. glutamicum a fost, de asemenea, mai mică de 1 g/l. A existat o diferență mică de producție de trans-Hyp între tulpinile recombinante de C. glutamicum cu aceeași genă p4hD, în ciuda faptului că unele tulpini au avut performanțe enzimatice și producție de prolină mai bune.

Utilizarea tulpinilor recombinante pentru a sintetiza direct trans-Hyp din glucoză prin fermentație a fost realizată deoarece atât enzimele cât și precursorii necesari în proces erau disponibili. Trans-P4H-urile străine supraexprimate au catalizat hidroxilarea L-prolinei în poziția trans-4, în timp ce 2- ketoglutaratul a fost furnizat de glucoză prin ciclul TCA și apoi decarboxilat oxidativ în succinat (figura 1). S-a raportat că prolina a fost solicitată în producția de Hyp de către E. coli recombinant numai cu gena p4h. Carbonul din prolina adăugată în timpul fermentației a trecut doar în aminoacizi sintetizați din intermediari ai ciclului TCA și nu în gluconeogeneză . Cu toate acestea, Hyp acumulat a fost la un nivel relativ ridicat chiar și fără adaos de prolină în acest studiu. Se poate înțelege că Corynebacterium avea o cale puternică de biosinteză a prolinei. Calea de biosinteză a prolinei a fost, de asemenea, identificată în E. coli, ceea ce poate contribui la sinteza trans-Hyp de către tulpinile recombinante de E. coli. Modificarea căii prolinei în E. coli a sporit producția de Hyp, în timp ce formarea de Hyp poate, de asemenea, să amelioreze inhibiția de feedback a prolinei . Cantitatea de prolină (0-4 mM) a favorizat producția de trans-Hyp. Cu toate acestea, adăugarea continuă de L-prolină nu a îmbunătățit semnificativ randamentul de producție (tabelul 2). În acest studiu, timpul de cultivare a fost semnificativ mai mic decât cele raportate în literatura de specialitate, ceea ce ar putea fi atribuit mediilor diferite utilizate și a indicat, de asemenea, că există un mare potențial de optimizare. De fapt, 2,28 g/L de trans-Hyp a fost produsă de E. coli recombinant fără adăugarea de L-prolină în flacoane cu o mică modificare a mediului și 6,72 g/L a fost obținută prin suplimentarea cu doar 4 mM L-prolină.

Pentru a crește în continuare biosinteza de trans-Hyp de către C. glutamicum și E. coli recombinant, ar trebui luate în considerare și abordări alternative. În E. coli, ar trebui să se depășească degradarea prolinei. Deși producția de trans-Hyp de către un mutant putA de E. coli nu a fost îmbunătățită în continuare, randamentul bazat pe prolina utilizată a fost mult îmbunătățit. Atât la C. glutamicum, cât și la E. coli, expresia P4H recombinant ca una dintre oxigenaze este implicată în metabolismul fiziologic al celulelor gazdă, inclusiv cofactorul, co-substratul și oxigenul. Mai mult, fără o cale de sinteză puternică a prolinei în E. coli, disponibilitatea și transportul substratului vor limita serios transformarea.

.