Analiza moleculelor cheie ale sistemului endocannabinoid (EC) 2-arachidonoil glicerol (2AG) și arachidonoil etanolamidă (anandamidă, AEA) reprezintă o provocare din cauza mai multor particularități. 2AG se izomerizează spontan în analogul său biologic inactiv 1-arachidonoil glicerol (1AG) prin migrare acilă și se distinge doar din punct de vedere cromatografic de 1AG. Efectele de matrice cauzate în primul rând de fosfolipidele co-extracte pot compromite și mai mult analiza. În plus, 2AG și 1AG sunt instabile în anumite condiții, cum ar fi evaporarea solventului sau reconstituirea extractelor uscate. Am examinat efectele diferiților solvenți organici și ale amestecurilor acestora, cum ar fi toluenul, acetatul de etil și cloroformul-metanol, asupra izomerizării 2AG/1AG, a stabilității 2AG/1AG și a efectelor de matrice în analiza UPLC-MS/MS a 2AG și AEA în plasma umană. Toluenul a împiedicat atât izomerizarea 2AG în 1AG, cât și degradarea 2AG/1AG în timpul evaporării. Extractele de toluen conțin doar 2% din fosfolipidele plasmatice care cauzează efecte de matrice, în comparație cu extractele din amestecul de solvenți utilizat în mod tradițional, cloroform-metanol. Toluenul și toți ceilalți solvenți organici testați oferă randamente comparabile de extracție a 2AG și AEA (60-80%). Pe baza acestor proprietăți favorabile ale toluenului, am dezvoltat și validat o metodă UPLC-MS/MS cu ionizare pozitivă prin electrospray (ESI+) care permite măsurarea simultană exactă și precisă a 2AG și AEA în plasma umană. Metoda UPLC-MS/MS a fost validată încrucișat cu o metodă GC-MS/MS descrisă anterior și complet validată pentru AEA în plasma umană. S-a observat o corelație strânsă (r(2)=0,821) între rezultatele obținute prin metodele UPLC-MS/MS (y) și GC-MS/MS (x) (y=0,01+0,85x). Metoda UPLC-MS/MS/MS este adecvată pentru măsurarea de rutină a 2AG și AEA în probele de plasmă umană (1 ml) în mediul clinic, după cum au demonstrat probele de plasmă de control al calității procesate pe o perioadă de 100 de zile. Metoda UPLC-MS/MS a fost extinsă în continuare la urina umană. În urină, AEA nu a fost detectabilă, iar 2AG a fost detectat în doar 3 din 19 probe de la subiecți sănătoși la 160, 180 și 212 pM, ceea ce corespunde la 12,3, 14,5 și, respectiv, 9,9 pmol/mmol de creatinină.