- Abstract
- 1. Introducere
- 2. Studiu de caz (descriere clinică)
- 3. Metode
- 3.1. Modelare structurală
- 4. Rezultate
- 4.1. Studii de structură-funcție
- 4.2. Efectele formării dimerului
- 5. Discuție
- 6. Concluzie
- Abbreviații
- Disponibilitatea datelor
- Consimțământul
- Conflicte de interese
- Contribuțiile autorilor
- Finanțare
- Recunoaștere
Abstract
Background. Proteina ATP-binding cassette, subfamilia D, membrul 1 (ABCD1) este un semitransportator peroxisomal care permite degradarea acizilor grași cu lanț foarte lung (VLCFA). Variantele patogene ale ABCD1 determină acumularea de VLCFA în diverse țesuturi și fluide corporale, ceea ce duce la o tulburare numită adrenoleucodistrofie legată de X (X-ALD). Această tulburare este marcată cel mai frecvent de insuficiență adrenocorticală și de o concentrație ridicată de VLCFA și are niveluri diferite de implicare neurologică în funcție de fenotip. De exemplu, forma de X-ALD exclusiv Addison nu are niciun impact neurologic, în timp ce forma cerebrală de X-ALD cauzează adesea pierderi senzoriale severe, afectarea funcțiilor motorii, declin cognitiv și deces. Metode. O variantă patogenă recent caracterizată și suspectată ca fiind patogenă în ABCD1 a fost analizată cu ajutorul platformei noastre informatice de proteine (PIP). Studiile moleculare personalizate la nivel de proteine au fost finalizate pe baza datelor de testare genetică, completând analiza și studiul clinic. Rezultate. Sunt prezentate un caz de adrenomieloneuropatie cu debut la adult (AMN) și o nouă variantă ABCD1. Este discutată proteina unică ABCD1, iar cazul probandului este comparat cu rapoartele existente de AMN. Concluzii. Fuziunea datelor din mai multe surse a fost combinată într-o abordare cuprinzătoare care a dus la o evaluare îmbogățită a bolii și a prognosticului pacientului. Modelarea moleculară a fost efectuată asupra variantei pentru a caracteriza mai bine semnificația sa clinică și pentru a confirma patogenitatea.
1. Introducere
Proteina ATP-binding cassette, subfamilia D, membrul 1 (ABCD1) face parte din superfamilia transportatorilor ATP-binding cassette, care constă din proteine transmembranare responsabile de trecerea lipidelor, metaboliților și a altor molecule între celule sau structuri intracelulare. Este codificată de ABCD1, o genă localizată la Xq28 . ABCD1 este un semitransportator peroxisomal care importă acizi grași cu lanț foarte lung (VLCFA) în peroxisom prin legarea ATP. ABCD1 disfuncțional nu reușește să mute VLCFA în peroxisom pentru a fi degradați, ceea ce duce la acumularea de VLCFA în fluidele și țesuturile corporale . Acest nivel anormal de VLCFAs servește drept biomarker caracteristic al adrenoleucodistrofiei legate de X (X-ALD), cea mai frecventă afecțiune peroxisomală . X-ALD este o afecțiune genetică asociată în principal cu demielinizare, neurodegenerare și insuficiență adrenocorticală . Au fost raportate peste 800 de variante în cadrul genei ABCD1 . În ciuda acestui fapt, nu au fost observate corelații clare genotip-fenotip .
Bărbații heterozigoți prezintă, de obicei, cele mai semnificative simptome, în timp ce femeile heterozigote dezvoltă adesea un grad mai mic de handicap mai târziu în viață . Cele trei fenotipuri clasice sunt doar boala Addison, adrenomieloneuropatia (AMN) și ALD cerebrală. Indivizii cu forma Addison-only disease-only prezintă, de obicei, insuficiență adrenocorticală între 2 și 7 ani. Degenerarea neurologică nu este prezentă inițial, dar se dezvoltă adesea pe măsură ce individul îmbătrânește . AMN debutează de obicei în al treilea sau al patrulea deceniu de viață și afectează în principal măduva spinării . Caracteristica clinică de prezentare este adesea rigiditatea și slăbiciunea progresivă a picioarelor. Insuficiența suprarenală este întâlnită la aproximativ 2/3 dintre pacienții cu AMN, iar modificările cerebrale afectează aproximativ jumătate dintre aceștia . ALD cerebrală este cel mai sever fenotip, în care demielinizarea cerebrală provoacă un declin rapid al auzului, vederii, funcției motorii și cogniției . Cel mai frecvent întâlnită la copii sau adolescenți, această variantă de X-ALD duce adesea la deces în termen de 2-4 ani de la prezentarea simptomelor .
Acest raport detaliază istoricul unui proband diagnosticat la 30 de ani cu AMN. Analiza moleculară a genei ABCD1 a identificat o variantă cu semnificație incertă la acest individ. În mod interesant, această variantă a fost raportată ca fiind patogenă în ALD Mutation Database, dar nu au fost publicate informații referitoare la cazul clinic. Cazul clinic al probandului nostru este inclus pentru a susține mai bine patogenitatea acestei variante ABCD1. Platforma informatică a proteinelor (PIP) a fost utilizată pentru o modelare moleculară cuprinzătoare pentru a caracteriza în continuare semnificația acestei variante și pentru a clarifica la diagnosticul probandului.
2. Studiu de caz (descriere clinică)
Probabilul a fost un bărbat în vârstă de 31 de ani care s-a prezentat pentru evaluarea unei afecțiuni neurologice progresive. Simptomele acestei afecțiuni au apărut pentru prima dată în urmă cu 2 ani, când probandul a început să se împiedice din ce în ce mai des. Ulterior, el ar fi prezentat slăbiciune și rigiditate musculară generalizată, împreună cu o disfuncție suplimentară a mersului. Pentru a combate această situație, probandul a folosit în ultimele 7 luni un umblător rulant pentru a-l ajuta să se deplaseze. De asemenea, a dezvoltat incontinență urinară. În plus, el a raportat ceață cerebrală, pierderi de memorie, deficite de atenție, anxietate și oboseală. Ca urmare, sarcinile mentale de bază necesitau mai mult timp pentru a fi îndeplinite. Conform probandului, consumul de alcool a exacerbat aceste deficite. În cele din urmă, probandul a pierdut 20 de kilograme de la debutul afecțiunii sale și nu a reușit să recupereze greutatea în ciuda eforturilor concertate în acest sens. Această pierdere în greutate s-a datorat parțial simptomelor de greață și vărsături, care au fost cel mai des întâlnite dimineața.
În timpul examinării fizice, probandul a fost incapabil să se ridice din poziția șezând fără a se folosi de mâini. A fost identificată o ușoară disartrie ataxică. Testele de fixare vizuală au relevat sacadări rare de unde pătrate. Urmările netede au fost sacadice, iar el a demonstrat sacadări lente și complete atât pe verticală, cât și pe orizontală. Reflexele de întindere au fost patologic de rapide la nivelul extremităților superioare. Probandezul avea, de asemenea, reflexe de întindere mitotice patologic de rapide la extremitățile inferioare, inclusiv clonus susținut la glezne. A fost prezentă o propriocepție moderat afectată a degetelor mari de la picioare. O slăbiciune ușoară a distribuției neuronilor motori superiori a fost observată la nivelul membrelor inferioare, fără a afecta iliopsoasul. Testarea de la călcâi la tibie a evidențiat dissinergia. În timp ce se deplasa, probandul își privea picioarele și se deplasa cu un pas redus. Genunchii săi erau în hiperextensie, avea tendința de a merge pe vârfuri și, ocazional, își aluneca picioarele. Semnul Romberg era prezent. În timp ce stătea în picioare, mișcările tremurătoare erau prezente în picioarele sale – predominant în cvadriceps. Probandezul s-a întors la 360 de grade pe parcursul a 3 încercări, ceea ce a necesitat între 9 și 15 pași pe tur. Reflexele sale posturale au fost anormale, iar testul „Pull” a fost -3.
IRM-ul creierului a fost normal, iar IRM-ul coloanei cervicale a relevat constatări care sugerează o atrofie ușoară și difuză a măduvei spinării. Nu a existat nicio dovadă de degenerare combinată subacută sau altă boală dobândită a măduvei spinării (figura 1). Fusese tratat pentru boala Lyme, deoarece titrurile IgM Lyme erau pozitive, dar nu s-a înregistrat nicio ameliorare semnificativă. Lichidul său cerebrospinal a fost descris ca fiind acelular. Evaluarea HIV, HTLV1, a hepatitei C, a hepatitei B și a citomegalovirusului s-a dovedit a fi negativă. Antecedentele familiale cu simptome similare nu au putut fi stabilite, deoarece cunoștințele probandului cu privire la istoricul medical al acestora erau limitate (Figura 2).
Profilul de acizi grași peroxisomali al probandului a fost obținut după testele și imagistica anterioare. Au fost prezente concentrații anormale de C26 : 0, C24/C22 și C26/C22, ceea ce a sugerat hemizigozitatea pentru adrenomieloneuropatia legată de X. Hormonul adrenocorticotropic a măsurat 528 pg/mL (RR: 7,2-63). S-a finalizat apoi secvențierea și analiza de deleție/duplicare a genei ABCD1. Probandul era hemizigot pentru o variantă cu semnificație incertă în ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Această variantă nu era prezentă în baza de date online ExAC, deși era listată ca patogenă în baza de date privind mutațiile ALD. Două variante similare, c.1596A>G (p.Lys533Glu) și c.1598A>G (p.Lys533Arg), au fost, de asemenea, raportate anterior ca fiind semnificative din punct de vedere clinic .
3. Metode
3.1. Modelare structurală
Secvența de membru 1 al subfamiliei D de casete de legare a ATP la om (cunoscută sub numele de ABCD1) este probabil o proteină transportoare, care are o regiune de legare a nucleotidelor cu un pliu care poate acționa ca o subunitate de legare a ATP cu activitate ATPază. Se știe că dimerizarea corectă este necesară pentru a forma un transportor activ. ABCD1 este un membru al subfamiliei ALD care participă la importul de acizi grași peroxisomali în organite. Acești transportatori ABC peroxisomali sunt „semitransportatori”, ceea ce înseamnă că au nevoie de o moleculă parteneră de semitransportor – forma funcțională este întotdeauna homodimerică sau heterodimerică. Se presupune că ABCD1 este cheia pentru transportul sau catabolismul peroxisomal al acizilor grași cu lanț foarte lung. Se știe că ABCD1 interacționează cu PEX19 și este codificat de gena ABCD1, care a fost preluată din secvența de accesare de referință NCBI: NP_000024: versiunea NP_000024.2, care este codificată pentru secvența de aminoacizi; și a fost utilizată pentru modelarea asistată de calculator. Simulările Monte Carlo au fost efectuate pe mutant pentru a permite modificări regionale locale pentru cei 745 de aminoacizi pe toată lungimea.
Afinajul cu raze X pentru Monte Carlo a fost construit folosind metoda YASARA SSP/PSSM . Structura a fost relaxată la câmpul de forță YASARA/Amber folosind potențiale bazate pe cunoaștere în cadrul YASARA. Lanțurile laterale și rotamerii au fost ajustate cu potențiale bazate pe cunoaștere, recoacere simulată cu solvent explicit și simulări de echilibrare mici folosind protocolul de rafinare din YASARA . Întreaga structură pe toată lungimea a fost modelată, completând orice lacune sau porțiuni nerezolvate din radiografia cu raze X.
Rafinarea modelelor finalizate a fost finalizată folosind fie modulul Schrodinger’s LC-MOD Monte Carlo-based, fie protocoalele NAMD2. Aceste rafinări au început cu rafinarea inițială generată de YASARA și varianta . Prin suprapunerea și rafinarea ulterioară a regiunilor suprapuse se obține un model complet pentru ABCD1. Structurile finale au fost supuse optimizării energetice cu gradient conjugat PR cu un dielectric dependent de R.
Consistența atomilor a fost verificată pentru toți cei 745 de aminoacizi (12.201 atomi) din modelul de tip sălbatic complet (WT) și 745 de aminoacizi (12.221 de atomi) pentru variantă, verificând corectitudinea denumirii lanțului, a diedrelor, a unghiurilor, a torsiunilor, a non-legăturilor, a electrostaticii, a tipării atomilor și a parametrilor. Este prezis un model de dimer, care constă din 24.402 atomi, inclusiv cofactorii și ionii. Fiecare model a fost exportat în următoarele formate: Maestro (MAE) și YASARA (PDB). Manipularea modelului s-a făcut cu Maestro (Macromodel, versiunea 9.8, Schrodinger, LLC, New York, NY, 2010), sau Visual Molecular Dynamics (VMD) . Analizele au fost accentuate pe regiunea N-terminală care conține primii 350 de aminoacizi, având în vedere lungimea și distanța C-term de la locul mutației.
Cercetarea dinamicii Monte Carlo (MC hibrid sau prin îmbunătățirea eșantionării MDS) a fost finalizată pe fiecare model pentru eșantionarea conformațională, folosind metode descrise anterior în literatura de specialitate . Pe scurt, fiecare sistem de variante ABCD1 a fost minimizat cu restricții relaxate utilizând fie Steepest Descent, fie Conjugate Gradient PR, apoi a fost lăsat să se supună criteriilor de căutare MC, așa cum se arată în literatura de specialitate . Scopul principal al MC, în acest scenariu, este examinarea oricărei variabilități conformaționale care poate apărea cu diferite mutații în regiunea din apropierea mutației și posibilul efect asupra legării la ADN sau a procesării cu ABCD1.
4. Rezultate
4.1. Studii de structură-funcție
Pentru WT față de varianta p.K533E, am constatat că stabilitatea obiectului din calculele energetice pentru ΔG pe aminoacid rămâne relativ aceeași, astfel că WT are o stabilitate a obiectului de 114,67 kcal/mol∗Å2. Varianta p.K533E determină o creștere netă a energiei libere de 2,321 kcal/aa∗mol∗Å2, care ar putea fi destabilizatoare pentru regiunea locală . Această stabilitate a obiectului a fost pozitivă, indicând faptul că unele modificări dinamice sunt probabile cu o simulare moleculară pentru eșantionarea conformațională. Astfel, am examinat reziduurile locale și am determinat că un calcul electrostatic poate fi util pentru a explica schimbarea funcției. Modelul molecular pentru structura completă și forma sa variantă sunt date [Figura 3(a)] folosind metodele noastre de ultimă oră, care au fost stabilite . Modelul dimeric este critic pentru funcție și arată interacțiuni importante la locul mutației care sunt întrerupte de mutația variantei.
Reziduurile locale aflate în limita de tăiere de 12 Å în apropierea situsului variantei (p.K533E) includ reziduuri din ambii monomeri. Monomerul care conține varianta (monomerul 1, carboni gri) are următoarele reziduuri din apropiere cu poziția 533-interacțiuni: E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 și K624 (figura 3(b)). Această structură variantă (p.Lys533Glu) a fost analizată și a fost indicată o perturbare mai directă a mediului local de la răsturnarea sarcinii pozitive a lizinei (+) la un acid glutamic negativ (-) care a fost destul de perturbator pentru reziduurile încărcate adiacente (mai sus). În special, reziduurile K624, E499 și Y532 sunt plasate în interacțiuni diferite (figura 3(b)). ΔG local pe aminoacid crește o valoare pozitivă netă care corespunde unei stabilități nefavorabile în buzunar și ar fi necesară o dinamică mai lungă pentru a determina efectul global, dar se poate aștepta să fie destabilizatoare. Reziduul K533E are interacțiuni interesante cu Q472, I474, I475 și E499. K533E se află într-o regiune elicoidală în care lanțul său lateral încărcat este poziționat spre exterior față de speciile cu sarcină opusă; există, de asemenea, o anumită interacțiune elicoidală cu elicele adiacente (figurile 3(b) și 3(c)). Aceleași reziduuri sunt implicate în variantă, dar poziția este schimbată pentru câteva dintre reziduuri, inclusiv P534, P535 și K624 [figura 3(c)]. Această interacțiune ar putea explica alterarea funcției datorită modificării comportamentului dinamic pentru stabilitatea structurală locală [figura 3(c)]. Calculele electrostatice au fost finalizate pentru o analiză suplimentară (figura 4). În special, reziduurile K624, E499 și Y532 sunt plasate în interacțiuni diferite (Figura 3(b)). ΔG local pentru fiecare aminoacid crește o valoare pozitivă netă care corespunde unei stabilități nefavorabile în buzunar și ar fi necesară o dinamică mai lungă pentru a determina efectul global, dar este de așteptat să fie destabilizatoare.
4.2. Efectele formării dimerului
Cartarea electrostaticii a fost realizată folosind calculul Poisson-Boltzmann pentru solvatare pe întreaga structură de 745 aminoacizi. Efectele modificărilor au fost puternic pronunțate asupra distribuției electrostatice cu un cutoff de +3 KT/E pentru ambele. Particula WT (toți cei 745 aa) prezintă o distribuție distinctă a sarcinii în jurul lui K533, care prezintă puține regiuni încărcate negativ și buzunare neutre mari datorită reziduurilor hidrofobe bogate găsite în elicele menționate mai sus. Mutația treoninei pare să schimbe distribuția sarcinilor și plasează poziția sarcinilor negative mai departe una de cealaltă, crescând în același timp dimensiunea regiunilor încărcate neutru [figurile 4(a) și 4(b)]. Regiunea locală p.K533E este încărcată pentru a potrivi reziduul pozitiv de lizină cu reziduurile de acid glutamic adiacente (în limita a 6 Å) [figura 4(b)]. Dimpotrivă, reziduul K533 are sarcini pozitive care sunt influențate de reziduurile aflate într-o rază de 6 Å, și anume E471, Q472, I474, I475, E499, Y532, P534, P535 și K624 (Figura 4(a)) . Varianta p.K533E nu pare să aibă niciun efect asupra dimerului în sine (figurile 3 și 4), deoarece varianta este distală față de interfața dintre monomeri. Cu toate acestea, există o perturbare semnificativă în vecinătatea locală, unde lizina este inserată în mod nativ într-un buzunar cu reziduurile sale apropiate care sunt încărcate opus și care se angajează în legături H și interacțiuni de punte salină, care se pierde odată cu sarcina negativă din substituția cu acid glutamic (Figura 3).
5. Discuție
Pentru pacienții cu AMN, opțiunile de tratament sunt în prezent limitate. Cu toate acestea, cercetările recente cu modele de șoareci reprezintă o soluție potențială. La pacienții cu X-ALD, acumularea de VLCFA este însoțită de niveluri crescute de specii radicale de oxigen. Acești radicali determină progresia bolii, deteriorând țesuturile și provocând în cele din urmă apariția simptomelor neurologice. Șoarecii cu analogii X-ALD au fost tratați cu succes cu un amestec de antioxidanți, aducând nivelurile de radicali sub control și oprind acest proces patogen . Dacă studiile ulterioare continuă să se dovedească promițătoare, este posibil ca probandul nostru și alți pacienți cu AMN să poată fi tratați într-o zi într-un mod similar.
Deși probandul nostru a prezentat o variantă slab înțeleasă în ABCD1, cazul său nu diferă semnificativ de fenotipul tipic al AMN. Simptomele au început la sfârșitul vârstei de 20 de ani, ceea ce se încadrează perfect în intervalul de vârstă așteptat, între 20 și 40 de ani. AMN are în mod obișnuit implicarea măduvei spinării, lucru care a fost confirmat de RMN-urile probandului. Slăbiciunea picioarelor sale și anomalia mersului sunt caracteristice bolii, la fel ca și incontinența urinară. Vărsăturile și greața sunt asociate cu insuficiența suprarenală, în timp ce anomaliile de vorbire și mentale ale probandului ar putea fi asociate cu modificări cerebrale . În ciuda acestui fapt, trebuie spus că un pacient care are aceeași variantă ABCD1 exprimată de probandul nostru ar putea prezenta simptome diferite. Variantele patogene în ABCD1 rareori au ca rezultat fenotipuri previzibile – chiar și atunci când o versiune identică este posedată de membrii familiei .
Informatica proteică derivată din calculele de mecanică statistică aplicate la modelarea moleculară pentru variantele față de tipul sălbatic ne oferă indicații clare pentru disfuncții ale comportamentului normal al proteinei la nivel molecular care ar avea impact asupra funcției. De exemplu, am constatat că varianta p.K533E determină o creștere netă a energiei libere de 2,321 kcal/aamolÅ2, ceea ce destabilizează regiunea locală pe o rază de 12 Å de la reziduul K533. Datorită modificării structurale locale atenuate prin intermediul reziduurilor din coloana vertebrală și a modificărilor de interacțiune din structura secundară (rețeaua de legături H nu este prezentată) permite mișcării corelate să se propage în întreaga structură, frustrând și mai mult formarea corectă a dimerului.
Datorită rarității variantei ABCD1 a probandului nostru, laboratorul comercial nu a fost în măsură să numească cu încredere varianta patogenă. În plus, provocările logistice și dimensiunea mică a familiei probandului au făcut ca analiza de segregare familială să fie nepractică. Ca urmare, acest proces nu a putut fi finalizat pentru a ne ajuta să înțelegem mai bine semnificația variantei sale. Din fericire, modelarea moleculară ne-a oferit o altă oportunitate. Modelarea moleculară a proteinelor a susținut suspiciunile că această variantă ar avea un impact asupra funcției proteice într-un mod semnificativ din punct de vedere clinic. A fost fără nicio suspiciune că această variantă nu ar fi fost clasificată drept patogenă, având în vedere alterarea grosieră a structurii, care a fost puternic susținută de analiza PIP.
6. Concluzie
În concluzie, raportăm un proband cu o variantă rară în ABCD1, c.1599G>T (p.Lys533Asn). Lipsa de informații cu privire la această variantă a împiedicat compania de testare genetică să clasifice varianta sa ca fiind patogenă, dar sarcinile moleculare par să indice că această regiune a proteinei este perturbată semnificativ față de echilibru (Figura 3(b)). Utilizarea modelării proteinei a furnizat, de asemenea, informații pentru încorporarea în tabloul clinic mai larg al probandului. În plus, un caz de patogenitate a acestei variante este listat în baza de date privind mutațiile ALD. Combinate, aceste dovezi au permis un diagnostic încrezător de AMN. Probandezul nostru a avut simptome tipice de AMN, dar variabilitatea fenotipică inerentă ABCD1 ar putea duce la o prezentare diferită a X-ALD pentru alte persoane care posedă această variantă.
Abbreviații
| ABCD1: | ATP-binding cassette, subfamilia D, membru 1 (genă) |
| VLCFA: | Acizi grași cu lanț foarte lung |
| X-ALD: | Adrenoleucodistrofie legată de X |
| AMN: | Adrenomieloneuropatie. |
Disponibilitatea datelor
Datele și materialele sunt detaliate în manuscris.
Consimțământul
Toate procedurile urmate au fost în conformitate cu standardele etice ale comitetului responsabil pentru experimente pe oameni (instituțional și național) și cu Declarația de la Helsinki din 1975, revizuită în 2000 (5). Consimțământul în cunoștință de cauză a fost obținut de la toți pacienții pentru a fi incluși în studiu.
Conflicte de interese
Toți autorii declară că nu au conflicte de interese.
Contribuțiile autorilor
Toți autorii de mai sus au contribuit substanțial la conceperea sau proiectarea lucrării; sau la obținerea, analiza sau interpretarea datelor pentru lucrare ȘI la redactarea lucrării sau la revizuirea critică a acesteia pentru consimțământul intelectual important ȘI au dat aprobarea finală a versiunii care urmează să fie publicată ȘI au fost de acord să fie responsabili pentru toate aspectele lucrării, asigurându-se că întrebările legate de acuratețea sau integritatea oricărei părți a lucrării sunt investigate și rezolvate în mod corespunzător.
Finanțare
Finanțarea a fost asigurată de Centrul pentru Medicină Individualizată, Clinica Mayo, care a furnizat fonduri pentru finalizarea acestui studiu.
Recunoaștere
TC mulțumește Centrului pentru Medicină Individualizată de la Clinica Mayo Jacksonville pentru sprijinul acordat pentru cercetare.
.