Din moment ce o cuantificare precisă a proteinelor este esențială pentru toate experimentele legate de studiul proteinelor, au fost dezvoltate diferite metode pentru a măsura concentrația de proteine într-un anumit test. Unele dintre cele mai tradiționale metode de cuantificare a proteinelor totale includ măsurarea absorbanței UV la 280 nm (A280), acidul bicinchoninic (BCA) și testele Bradford, precum și alte metode alternative, cum ar fi Lowry și alte teste noi.
Din moment ce proteinele absorb lumina la o anumită lungime de undă, măsurarea poate fi obținută cu ajutorul unui spectrofotometru. În mod specific, aminoacizii tirozină și triptofan au o absorbție foarte specifică la 280 nm, permițând măsurarea directă A280 a concentrației de proteine.
Absorbția UV la 280 nm este utilizată în mod obișnuit pentru a estima concentrația de proteine în laboratoare datorită simplității, ușurinței în utilizare și accesibilității sale. Măsurătorile sunt rapide și foarte reproductibile, deoarece nu este nevoie de incubare. În plus, această metodă necesită, de asemenea, un volum de probă extrem de mic, deoarece spectrofotometrele moderne utilizează un sistem de retenție a probei în timpul măsurării.
Totuși, trebuie avut grijă să se asigure că proba de proteină nu conține componente neproteice (de exemplu, acizi nucleici) cu același spectru de absorbție, deoarece aceasta poate duce la rezultate eronate. În afară de determinarea concentrațiilor de proteine, valorile de absorbție pot fi, de asemenea, utilizate în detectarea modificărilor conformaționale și a legării ligandului și pentru urmărirea reacțiilor enzimatice.
Efectul triptofanului și tirozinei în cuantificarea proteinelor
Datorită prezenței tirozinei și triptofanului, proteinele și peptidele care conțin acești aminoacizi aromatici absorb lumina UV la o lungime de undă de 280 nm. Fiecare dintre aceste reziduuri are lungimi de undă de absorbție și emisie distincte și variază în ceea ce privește randamentele cuantice. Fenilalanina și legăturile disulfidice contribuie, de asemenea, la absorbția la această lungime de undă, dar, întrucât este relativ nesemnificativă, poate fi observată numai în absența atât a triptofanului, cât și a tirozinei.
Mulți cofactori enzimatici care conțin structuri de inele aromatice (de exemplu FMN, FAD, NAD și porfirine) absorb, de asemenea, lumina UV pentru excitare și, prin urmare, se adaugă la intensitatea fluorescenței rezultate. Proteinele speciale, cum ar fi proteina fluorescentă verde, au, de asemenea, o secvență internă de serinetyrosină-glicină care este modificată post-translațional și este fluorescentă în regiunea luminii vizibile.
Triptofanul
Triptofanul este semnificativ mai fluorescent decât tirozina și fenilalanina. Cu toate acestea, proprietățile sale fluorescente sunt dependente de solvent, adică spectrul se deplasează spre lungimi de undă mai scurte și crește în intensitate pe măsură ce scade polaritatea solventului. Ca atare, reziduurile de triptofan îngropate în domeniile hidrofobe ale proteinelor pliate prezintă o deplasare spectrală de 10 până la 20 nm.
Datorită absorbției sale mai mari, randamentului cuantic mai mare și transferului de energie de rezonanță, spectrul de fluorescență al unei proteine care conține cei trei aminoacizi seamănă de obicei cu cel al triptofanului.
Tirosina
Tirosina poate fi excitată la lungimi de undă asemănătoare cu cea a triptofanului, dar va emite la o lungime de undă distinct diferită. Deși poate fi adevărat că tirozina este mai puțin fluorescentă decât triptofanul, ea poate furniza un semnal semnificativ, deoarece este adesea prezentă în număr mare în multe proteine. S-a observat că fluorescența tirozinei este stinsă de prezența fracțiunilor de triptofan din apropiere, fie prin transfer de energie de rezonanță, fie prin ionizarea grupării sale hidroxilice aromatice.
Iată câteva puncte importante de reținut atunci când se măsoară peptidele prin metoda A280.
- Proteinele cu greutate moleculară similară pot avea valori de absorbție diferite datorită diferenței în conținutul de triptofan și tirozină.
- Absorbția UV este, de asemenea, afectată de structura proteică. Astfel, condițiile care afectează structura (cum ar fi temperatura, pH-ul, puterea ionică sau prezența detergenților) pot afecta capacitatea reziduurilor aromatice de a absorbi lumina la 280 nm și pot modifica valoarea coeficientului de extincție al proteinei.
- Mediul local al aminoacizilor aromatici poate avea un efect asupra spectrelor acestora. Acest lucru înseamnă că triptofanul va avea un vârf de emisie la lungimi de undă mai mici atunci când este îngropat în regiunile interne hidrofobe ale unei proteine, în timp ce tirozina își va transfera adesea energia către aminoacizii triptofanici adiacenți. Tirosinatul ionizat, care se formează atunci când protonii sunt pierduți din tirozină ca urmare a creșterii pH-ului, va demonstra lungimi de undă similare cu cele ale triptofanului.
.