Două reziduuri de aminoacizi determină sensibilitatea la 2-APB a canalelor ionice TRPV3 și TRPV4

Rezultate

Identificarea mutațiilor care afectează în mod specific răspunsurile la 2-APB.

Am analizat o bibliotecă de mutanți TRPV3 de șoarece constând din ≈14.000 de construcții ADNc purtând în medie 2,5 mutații pe clonă generate prin PCR predispusă la erori. Construcțiile mutante au fost transfectate în celule de rinichi embrionar uman (HEK293), iar răspunsurile la calciu evocate de căldură (42 °C), 25 μM 2-APB și 1,75 mM camfor au fost monitorizate într-un cititor de plăci cu imagistică fluorescentă (FLIPR). Am descris recent identificarea reziduurilor necesare în mod specific pentru activarea termică a TRPV3 (20). Aici, ne-am concentrat pe setul de date 2-APB și camfor pentru a identifica reziduurile necesare în mod specific pentru răspunsurile chimice.

În mod specific, am selectat clonele care au prezentat răspunsuri normale pentru o substanță chimică, dar activare semnificativ redusă de cealaltă (pentru criteriile de selecție, a se vedea Metode). Clonele pozitive au fost culese, reînsămânțate și au fost măsurate curbele complete doză-răspuns față de fiecare stimul, iar valorile EC50 au fost calculate (a se vedea Metode). Șapte clone mutante au fost confirmate ca fiind în mod specific deficitare de 2-APB și au fost secvențiate. În mod remarcabil, toate cele 7 clone au inclus mutații în 1 din 2 reziduuri. Primul, histidina (H) 426, este prezentă în regiunea citoplasmatică N-terminală, între domeniul ankyrin și cel transmembranar. Am identificat 4 substituții distincte ale H426 în cadrul screening-ului (tabelul 1). Cea de-a doua, arginina (R) 696, este prezentă în caseta C-terminală citoplasmatică TRP (IWRLQR), un domeniu conservat în canalele TRP (2, 3). Cele 3 mutații la acest reziduu au aceeași substituție strâns legată între arginină și lizină. Toate cele 7 mutații au cauzat deficite severe în răspunsurile la 2-APB, fără a afecta răspunsurile la camfor (tabelul 1). Deși au fost identificate, de asemenea, câteva clone cu deficit de camfor, acestea au fost mutații relativ mai subtile, schimbând valorile EC50 ale camforului de ≈2 ori sau mai puțin (datele nu sunt prezentate). Din acest motiv, ne-am concentrat acest studiu asupra celor 2 reziduuri care cauzează în mod specific >10 ori deficitul de 2-APB.

Caracterizarea electrofiziologică inițială a canalelor TRPV3-H426 și TRPV3-R696.

FLIPR este o modalitate indirectă de măsurare a activității canalelor ionice. Pentru a confirma rezultatele noastre FLIPR, am folosit tehnica patch clamp și am măsurat curenții celulelor întregi ale TRPV3 de șoarece de tip sălbatic, TRPV3-H426N și TRPV3-R696K atunci când 2-APB (1 μM până la 3 mM) sau camforul (0,3 până la 20 mM) au fost aplicate individual în baie de la concentrații mici la mari (Fig. 1 și Fig. S1). Într-o manieră dependentă de concentrație, 2-APB a activat curenții în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3 de tip sălbatic cu valori medii ale EC50 de 25,9 ± 0,3 (nHill = 2,3) și 36,8 ± 3.6 μM (nHill = 3,3) la +100 și respectiv -100 mV, (Fig. 1A; Fig. S1A); 2-APB nu a indus curenți măsurabili în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3-H426N până la 100 μM. Cu toate acestea, concentrațiile de 2-APB care sunt saturate pentru TRPV3 de tip sălbatic (0,3 până la 3 mM) au fost capabile să activeze curenți în acest mutant într-o manieră dependentă de concentrație (Fig. 1A; Fig. S1A). În consecință, TRPV3-H426N a prezentat o deplasare a EC50 de >10 ori a activării dependente de 2-APB, iar răspunsul nu a ajuns niciodată la saturație. În experimentele paralele, camforul a activat, de asemenea, curenții în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3 de tip sălbatic într-o manieră dependentă de concentrație, cu valori EC50 de 6,7 ± 0,1 (nHill = 7,8) și 7,0 ± 0,1 mM (nHill = 8,4) la +100 și, respectiv, -100 mV. În mod important, au fost observate răspunsuri de tip sălbatic la camfor în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3-H426N , confirmând faptul că activarea camforului este nealterată în acest mutant (Fig. 1A; Fig. S1B).

În experimentele de patch-clamp cu celule întregi, 2-APB a indus, de asemenea, o activare minimă a TRPV3-R696K. La +100 mV, 2-APB a început să activeze celulele HEK293 care exprimă acest canal mutant la ≈3 μM, și a ajuns la saturație la 30 μM, cu o EC50 de 10,0 ± 1,3 μM (nHill = 2,1). Concentrații mai mari de 2-APB (>30 μM) au evocat un curent de desensibilizare cu un „off-response” după spălarea 2-APB, un fenomen care este descris în detaliu mai jos. Cu toate acestea, la -100 mV, 2-APB nu a reușit să activeze canalele mutante R696K nici măcar la 1 mM (Fig. 1B; Fig. S1A). Răspunsul maxim al 2-APB la 1 mM la -100 mV a fost de -2,3 ± 1,4 pA/pF (n = 6), care este semnificativ mai mic (>10 ori) decât pentru canalele TRPV3 de tip sălbatic (-482,1 ± 69,2 pA/pF la 300 μM, n = 17), sugerând că răspunsul maxim al canalului evocat de 2-APB este diminuat în mutantul TRPV3-R696K. Cu toate acestea, camforul a activat răspunsuri similare la celulele HEK293 transfectate cu TRPV3- și TRPV3-R696K (Fig. 1B; Fig. S1B). Prin urmare, datele electrofiziologice inițiale au confirmat rezultatele noastre de screening conform cărora mutanții TRPV3-H426N și TRPV3-R696K sunt deficitari în ceea ce privește capacitatea de răspuns la 2-APB, fără a afecta funcția generală a canalului, așa cum a fost testată prin capacitatea lor de a răspunde la camfor.

Am întrebat în continuare ce proprietăți ale catenelor laterale ale H426 și R696 sunt cruciale pentru activarea TRPV3 de către 2-APB. Am mutat individual pozițiile 426 și 696 în toți ceilalți aminoacizi și am măsurat curbele de răspuns la doză FLIPR atât pentru 2-APB cât și pentru camfor. În mod interesant, toți mutanții H426 au avut răspunsuri reduse la 2-APB cu o creștere puternică (>10 ori) a valorilor EC50 (Tabelul S1). Majoritatea mutanților au avut răspunsuri normale la camfor, cu excepția substituției de prolină cu rupere de helix, care a prezentat o creștere de ≈2 ori a EC50 a camforului. Datele sunt în concordanță cu rezultatul screening-ului nostru primar care a identificat 4 substituții diferite care au ca rezultat deficiența de 2-APB în această poziție. Canalele mutante care poartă lanțurile laterale aromatice F, T și W nu au răspuns nici la camfor, nici la 2-APB. Cu toate acestea, majoritatea mutanților R696 au prezentat răspunsuri reduse la 2-APB, dar au avut, de asemenea, răspunsuri maxime reduse la camfor (20 mM), ceea ce indică faptul că aceste mutații afectează expresia sau funcția generală a canalului (tabelul S2). Acest rezultat este, de asemenea, în concordanță cu rezultatul nostru inițial din screeningul primar, unde doar substituția lizinei a fost identificată ca fiind specific necesară pentru 2-APB la acest reziduu. R696F a prezentat, de asemenea, un anumit deficit specific 2-APB, deși răspunsurile maxime la camfor au fost ușor afectate. Mutanții R696D, R696G, R696N, R696P, R696S și R696T nu au prezentat răspunsuri semnificative nici la 2-APB, nici la camfor, în comparație cu celulele transfectate cu vectorul pcDNA.

Răspunsul dependent de tensiune a rămas intact la mutanții 2-APB.

S-a demonstrat că dependența de tensiune are roluri importante în activarea și blocarea canalelor TRP (1, 10-12, 21). În absența stimulatorilor chimici (de exemplu, camfor sau 2-APB), pașii de tensiune de la -120 la +180 mV (pas de 20 mV) nu au activat curenții în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3 de tip sălbatic, ceea ce indică faptul că TRPV3 (spre deosebire de TRPV1 și TRPM8) nu este activat doar de tensiune în intervalul testat aici (20, 22). Cu toate acestea, în prezența a 30 μM 2-APB, a fost activat un curent dependent de tensiune (Fig. S2A). După cum era de așteptat, nu s-a observat niciun curent detectabil modulat de tensiune în TRPV3-H426N atunci când a fost tratat cu 30 μM 2-APB (Fig. S2B). Cu toate acestea, 6 mM camfor a evocat un curent dependent de tensiune în celulele HEK293 care exprimă TRPV3 de tip sălbatic (V1/2 de 81,3 ± 2,6 mV) (Fig. S2 A și D) și TRPV3-H426N (V1/2 de 81,3 ± 2,5 mV) (Fig. S2 B și D). Similar cu TRPV3-H426N, nu a existat niciun curent detectabil modulat de tensiune în TRPV3-R696K atunci când a fost tratat cu 30 μM 2-APB (Fig. S2C). Cu toate acestea, camforul a activat un curent dependent de tensiune cu un V1/2 de 81,1 ± 5,4 mV (Fig. S2 C și D). Aceste rezultate indică faptul că modularea voltajului este intactă în TRPV3-H426N și TRPV3-R696K și implică faptul că pierderea dependenței de voltaj este puțin probabil să fie cauza scăderii răspunsurilor la 2-APB în aceste canale mutante.

Sensibilitatea la temperatură a TRPV3-H426N și TRPV3-R696K.

Sensibilitatea la temperatură este un semn distinctiv al funcției canalului TRPV3 (14, 16, 23). Prin urmare, am întrebat dacă activarea temperaturii a fost alterată în clonele TRPV3-H426N și TRPV3-R696K. Am măsurat activarea la temperatură (25 până la 42 °C) a celulelor HEK293 transfectate cu TRPV3 de tip sălbatic, TRPV3-H426N sau TRPV3-R696K mutant într-un test FLIPR. Răspunsurile la căldură ale TRPV3-H426N au fost fie egale, fie ușor mai mari decât răspunsurile TRPV3 de tip sălbatic (n = 4 experimente), sugerând că activarea 2-APB și activarea termică pot fi separate (Fig. S2E; și datele nu sunt prezentate). Cu toate acestea, răspunsurile la căldură în TRPV3-R696K au fost mult mai mici în comparație cu tipul sălbatic (n = 3 experimente), sugerând că acest mutant nu modifică în mod specific activarea 2-APB (Fig. S2E).

Desensibilizarea dependentă de calciu a TRPV3-R696K.

O caracteristică interesantă a răspunsului la 2-APB în celulele HEK293 transfectate cu TRPV3-R696K este desensibilizarea rapidă la >30 μM 2-APB și o lipsă de răspuns la 2-APB la concentrații mari (Fig. S3). Acest fenomen este în contrast cu TRPV3 de tip sălbatic, care se sensibilizează ca răspuns la stimularea repetitivă/continuă a substanțelor chimice sau a căldurii (14, 16). Se propune ca mecanismul care stă la baza sensibilizării TRPV3 să fie o pierdere a inhibiției de calciu a acestui canal (22). Deoarece desensibilizarea majorității celorlalte canale TRP (cum ar fi TRPV1 și TRPA1) la stimuli chimici sau de temperatură depinde, de asemenea, de calciul extracelular (24, 25), ne-am propus să testăm dacă calciul extracelular are un rol în răspunsurile de desensibilizare provocate de 2-APB în TRVP3-R696K. În mod surprinzător, în absența calciului extracelular, 100 μM 2-APB a activat un curent de intrare și ieșire robust, de tip sălbatic, în TRPV3-R696K (densitatea de curent a TRPV3-R696K: 755.7 ± 200,0 pA/pF la +100 mV, -641,2 ± 133,9 pA/pF la -100 mV (n = 5); TRPV3 de tip sălbatic: 615,0 ± 266,7 pA/pF la +100 mV și -471,0 ± 83,2 pA/pF la -100 mV, n = 9) (Fig. S4 A și B). Acest rezultat sugerează că înlocuirea unei arginine cu o lizină la poziția 696 în caseta TRP a TRPV3 conduce canalul într-o stare de desensibilizare la stimularea cu 2-APB, dar nu cu camfor, într-o manieră dependentă de calciu. Un reziduu putativ de legare a Ca2+ în domeniul buclei porului, aspartatul 641, este conservat între toate canalele TRPV și este esențial pentru proprietățile de permeabilitate ale canalelor TRP (26, 27). S-a demonstrat că mutarea lui D641 în asparagină (N) reduce blocajul cu roșu de ruteniu și inhibarea cu mare afinitate a calciului extracelular a TRPV3 și a altor canale TRP (17, 22, 26, 27). Prin urmare, am examinat dacă mutația D641N ar putea scuti clona TRPV3-R696K de pierderea dependentă de calciu a răspunsului 2-APB. Într-un test FLIPR, TRPV3-D641N a avut o EC50 de 2,8 ± 1,3 μM (nHill = 0,7), care este aproximativ jumătate din valoarea TRPV3 de tip sălbatic (5,7 ± 1,2 μM, nHill = 1,1). Dublul mutant dublu TRVP3-D641N/R696K a avut o EC50 de 3,3 ± 1,1 μM (nHill = 1,1), arătând că mutația D641N a restabilit complet răspunsul la 2-APB al TRPV3-R696K. După cum era de așteptat, răspunsul la camfor a fost similar între TRPV3, TRPV3-R696K, TRPV3-D641N și TRPV3-D641N/R696K (Fig. S4 C și D). Aceste studii demonstrează că TRPV3-R696 nu este pur și simplu o mutație 2-APB. Deficiențele observate sunt mediate de calciu, afectând răspunsurile la 2-APB, dar nu și la camfor.

Sensibilitatea la 2-APB în ortologii TRPV3.

Conservările de aminoacizi și variațiile dintre ortologi sunt instrumente utile pentru disecarea relațiilor structură-funcție ale proteinelor, inclusiv ale canalelor TRP (28, 29). Prin urmare, am întrebat dacă acești ortologi TRPV3 au răspunsuri comparabile la camfor și 2-APB. Într-adevăr, canalele TRPV3 umane, de câine și de broască, care au histidine la poziția 426 echivalentă cu cea a șoarecelui (Fig. 2A), au răspunsuri similare la 2-APB atunci când sunt supraexprimate în celulele HEK293 (deși răspunsurile la camfor în TRPV3 Xenopus tropicalis au fost diminuate în comparație cu TRPV3 de șoarece de tip sălbatic) (Fig. 2C). După cum era de așteptat, atunci când H426 la om, câine și broască a fost mutat în N, curbele de răspuns la concentrația de 2-APB au fost puternic deplasate spre dreapta în fiecare dintre acești ortologi TRPV3 (Fig. 2B). Din nou, această mutație nu a scăzut sensibilitatea la camfor în comparație cu ortologii TRPV3 de tip sălbatic (Fig. 2C). Dimpotrivă, atât mutanții TRPV3 H426N umani, cât și cei ai broaștei au avut o sensibilitate la camfor ușor mai mare decât omologii lor de tip sălbatic. Aceste rezultate indică faptul că mecanismul de activare cu 2-APB al TRPV3 ar putea fi conservat în diferite specii.