Expresia genelor transportoare de colesterol ABCA1 și ABCG1 în celulele mononucleare din sângele periferic la pacienții cu sindrom metabolic

Abstract

Genele ABCA1 și ABCG1 codifică proteinele transportoare de colesterol care joacă un rol cheie în homeostazia colesterolului și a fosfolipidelor. Acest studiu a avut ca scop evaluarea și compararea expresiei genelor ABCA1 și ABCG1 la pacienții cu sindrom metabolic și la persoanele sănătoase. Acest studiu caz-control a fost realizat pe 36 de pacienți cu sindrom metabolic și pe același număr de indivizi sănătoși din Hamadan (vestul Iranului) în perioada 2013-2014. ARN-ul total a fost extras din celulele mononucleare și purificat cu ajutorul coloanei RNeasy Mini Kit. Expresia genelor ABCA1 și ABCG1 a fost realizată prin qRT-PCR. Profilul lipidic și glicemia la jeun au fost măsurate prin proceduri colorimetrice. Expresia ABCG1 la pacienții cu sindrom metabolic a fost semnificativ mai mică (aproximativ 75%) în comparație cu cea a grupului de control, în timp ce pentru expresia ABCA1, nu a existat nicio diferență semnificativă între cele două grupuri studiate. Comparația altor parametri, cum ar fi HDL-C, FBS, IMC, circumferința taliei și tensiunea arterială sistolică și diastolică între pacienții cu sindrom metabolic și persoanele sănătoase a arătat diferențe semnificative (). Scăderea expresiei ABCG1 la pacienții cu sindrom metabolic în comparație cu indivizii sănătoși sugerează că hiperglicemia, metaboliții asociați și hiperlipidemia peste capacitatea de transport au dus la scăderea expresiei ABCG1. Absența unei modificări semnificative a expresiei genei ABCA1 între cele două grupuri poate indica un mecanism de reglare diferit pentru expresia ABCA1.

1. Introducere

Sindromul metabolic (MetS) este definit ca un set de factori de risc interrelaționați de diabet și boli cardiovasculare (CVD) . Există unele criterii pentru diagnosticul clinic al sindromului metabolic care includ circumferința taliei ridicată (≥102 cm la bărbați și ≥88 cm la femei), trigliceride ridicate (≥150 mg/dL sau 1.7 mmol/L), lipoproteine-colesterol de înaltă densitate redus (HDL-C <40 mg/dL sau 1,03 mmol/L la bărbați și <50 mg/dL sau 1,3 mmol/L la femei) și tensiune arterială crescută (≥130 mm Hg tensiune arterială sistolică sau ≥85 mmHg tensiune arterială diastolică) . MetS poate fi diagnosticat prin observarea a trei dintre aceste criterii. În ultimii câțiva ani, prevalența MetS a crescut la nivel mondial ; cu toate acestea, în Statele Unite ale Americii, aceasta a scăzut de la 25,5% în 1999/2000 la 22,9% în 2009/2010 . Weiss și colegii au raportat că obezitatea este direct asociată cu o prevalență crescută a MetS . Există o asociere inversă între MCV și nivelul plasmatic al HDL-C, unul dintre criteriile sindromului metabolic . Lipoproteinele de înaltă densitate, o subfracție a lipoproteinelor circulatorii, joacă un rol important în transportul colesterolului din țesutul periferic către celulele hepatice . HDL este bogată în proteinele Apo A-I și Apo A-II, iar mai mult de două treimi din conținutul său este reprezentat de Apo A-I .

Transportatorii transmembranari ABC au un rol important în absorbția colesterolului de la macrofage la HDL și diminuează formarea de celule spumoase . ABCA1 compus din 2261 aminoacizi este prezent în majoritatea țesuturilor. În ultimii ani, s-a demonstrat că ABCA1 joacă un rol esențial în protecția împotriva bolilor cardiovasculare . Sinteza HDL depinde în mod direct de activitatea ABCA1 în celulele hepatice; cu alte cuvinte, acesta are o funcție cheie în protecția celulelor arteriale împotriva celulelor spumoase prin creșterea HDL plasmatice. Activitatea ABCA1 a macrofagelor arteriale a demonstrat o asociere inversă cu formarea de celule spumoase, deoarece odată cu creșterea activității sale se va reduce formarea de celule spumoase .

Activitatea ABCA1 redusă sau alterată ar putea cauza unele boli cum ar fi diabetul de tip 2 , boala Tangier și boli cardiovasculare premature .

Gena ABCG1 este localizată pe cromozomul 21q22.3 . Atât ABCA1 cât și ABCG1 conduc la reducerea colesterolului tisular prin efluxul acestuia către HDL, dar ABCG1 transportă colesterolul tisular către HDL2 și HDL3, iar ABCA1 îl transportă către Apo A-I fără lipide . Macrofagele sunt cel mai important țesut de acțiune al ABCA1 și ABCG1 . În multe studii au fost examinate efectele upreglementării și downreglementării acestor gene.

Efluxul redus de colesterol este consecința lipsei de expresie ABCA1 in vitro ; poate duce la creșterea aterosclerozei , dar upreglementarea ABCA1 duce la reducerea aterosclerozei . Scăderea ABCG1 are, de asemenea, aceleași efecte asupra efluxului de colesterol, dar există rezultate controversate cu privire la impactul scăderii ABCG1 asupra aterosclerozei .

În MetS, modelele de expresie ale unor gene se modifică și pot duce la obezitate, diabet și hipertensiune. În studiul de față, ne-am propus să evaluăm expresia genelor ABCA1 și ABCG1 la pacienții cu MetS, deoarece aceste gene sunt implicate în sinteza transportatorilor care au un rol crucial în transportul colesterolului.

2. Materiale și metode

2.1. Materiale și metode

2.1. Subiecți

Acest studiu caz-control a fost efectuat pe pacienți care au fost trimiși la o secție de endocrinologie într-un spital din Hamadan (vestul Iranului) în perioada 2013-2014. Au fost selectați treizeci și șase de pacienți cu sindrom metabolic. De asemenea, ca grup de control au fost selectați 36 de indivizi sănătoși, potriviți ca vârstă și sex. Niciunul dintre indivizii sănătoși nu a avut criteriile de sindrom metabolic.

Criteriul de includere în grupul cu sindrom metabolic a fost să aibă trei din cele cinci caracteristici menționate mai sus. Pacienții cu antecedente de consum de medicamente antilipidice, contraceptive și diuretice au fost excluși din studiu. Au fost excluși și pacienții gravide și pacienții cu diabet, inflamație și infecție.

2.2. Prelevarea sângelui

Un eșantion de sânge de 2,5 ml de la fiecare subiect a fost adăugat într-un tub care conține EDTA și a fost păstrat la 4°C pentru extragerea ARN-ului (nu mai mult de două ore mai târziu).

2.3. Extracția de celule mononucleare din sângele periferic (PBMC)

Soluțiile Lymphodex (Germania) și Henx (Iran) au fost utilizate pentru izolarea PBMC. Aproximativ 2 ml de soluție Henx au fost adăugate la un volum egal de sânge și au fost amestecate complet; apoi au fost turnate pe 3 ml de soluție Lymphodex cu atenție și încet. Ulterior, amestecul a fost plasat pe Lymphodex și a fost centrifugat la 1000 g timp de 20 de minute. Stratul alb intermediar dintre plasmă și Lymphodex a fost izolat ca celule mononucleare (MCs); apoi s-a adăugat tamponul Henx pe MC, s-a amestecat complet și s-a centrifugat. În cele din urmă, supernatantul a fost aruncat și procesul a fost repetat încă o dată.

2.4. Extracția ARN-ului și sinteza ADNc

Extragerea netă a ARN-ului a fost realizată cu ajutorul kitului Gene JET RNA Purification în conformitate cu protocolul producătorului. Calitatea și cantitatea de ARN purificat au fost analizate cu ajutorul NanoSpectrofotometrului (Epoch, BioTek, SUA); apoi, integritatea fiecărei probe de ARN a fost examinată cu ajutorul gelului de agaroză 1%, 1x TBE.

ARN-ul a fost convertit în ADNc folosind RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622) prin respectarea protocolului: etapa 1: recoacerea amorselor la 25°C timp de 5 min; etapa 2: sinteza ADNc la 42°C timp de 60 min; etapa 3: inactivarea termică la 70°C timp de 5 min. Produsele au fost păstrate la -80°C pentru următoarele etape.

2.5. Proiectarea amorselor

Amorsorii specifici pentru fiecare genă au fost proiectați cu software-ul Allele ID (versiunea 7.6). Pentru a crește specificitatea reacției PCR în timp real și pentru a reduce rezultatele fals pozitive, una dintre perechile de primer a fost proiectată pentru a fi atașată la zona de joncțiune Exon-Exon. Criteriile amănunțite ale primerilor utilizați pentru fiecare genă sunt prezentate în tabelul 1. Gena de menținere a ARNr 18S a fost utilizată ca și control intern.

Expresia relativă a genelor a fost calculată prin măsurarea valorii ciclului de prag (CT) pentru fiecare probă utilizând termociclatorul C1000 și sistemul în timp real CFX96 (Bio-Rad, SUA) și kitul SYBR Premix Ex Taq 2 (TakaRa nr. RR820L). Media CT în triplicat pentru fiecare probă a fost determinată ca valoare CT. Cantitățile de ingrediente ale reacției qRT-PCR au inclus 10 μL de SYBR verde, 7 μL de apă deionizată și 1 μL din fiecare dintre amorsă directă, amorsă inversă și șablon. qRT-PCR a fost realizată în următoarele condiții: activare inițială la 95°C timp de 30 de secunde și apoi 40 de cicluri cu următoarele etape repetate: denaturare la 95°C timp de 5 secunde, aneantizare la temperatura de aneantizare optimizată pentru durata corespunzătoare fiecărei gene și extensie la 72°C timp de 30 de secunde, iar la final, datele au fost obținute prin creșterea temperaturii de la 72°C la 95°C timp de 0,5°C/0,05 secunde. Apoi, produsele PCR au fost electroforezate (pe gel de agaroză 1%, 1x TBE) pentru a verifica specificitatea ampliconilor.

2.6. Evaluarea factorilor biochimici serici

Un eșantion de sânge de doi mililitri a fost colectat de la fiecare subiect și centrifugat la 3000 rpm timp de 10 min pentru separarea serului. Colesterolul total (TC), LDL-C, TG, FBS și HDL-C au fost examinate cu ajutorul kitului Pars Azmun (Iran) de către Hitachi 911 (Germania).

2.7. Analiza și interpretarea rezultatelor

formula a fost utilizată pentru analiza expresiei genetice relative a grupurilor cu sindrom metabolic și de control. Eficiența PCR în timp real a fost calculată pentru fiecare genă prin utilizarea diluției 10-2; ulterior, numărul obținut a fost plasat la următoarea formulă de calcul pentru măsurarea schimbărilor fold ale expresiei genice :Pentru analiza statistică cu intervale de încredere de 95% a fost utilizat software-ul SPSS V.16. Distribuția normală a variabilelor a fost verificată prin metoda Kolmogorov-Smirnov și apoi valorile au fost comparate între două grupuri prin testul eșantioanelor independente.

3. Rezultat

Caracteristicile demografice și factorii biochimici ai grupurilor studiate sunt prezentate în tabelul 2. Raportul bărbați/femei a fost de 1/3 în fiecare grup (12 M și 24 F). După cum se arată în tabelul 2, diferențele la toți parametrii examinați au fost semnificative din punct de vedere statistic între cele două grupuri (), cu excepția vârstei și a LDL-C. Grupul cu sindrom metabolic a avut un IMC mai mare, LDL-C, TC, TG, FBS, tensiunea arterială diastolică/diastolică și circumferința taliei în comparație cu indivizii sănătoși, în timp ce HDL-C a fost semnificativ mai mic în cazul sindromului metabolic.

3.1. Rezultatele qRT-PCR

După finalizarea reacției PCR, rezultatele au fost verificate prin analiza curbei de reacție, a curbei de topire a produselor și prin electroforeza produselor PCR. Electroforeza a fost efectuată pe agaroză 1% folosind o scară de ADN de 100 bp. Rezultatele sunt prezentate în figura 1.

Figura 1

Electroforeze pe gel de agaroză ale produselor RT-PCR: banda 1, produsele ABCG1 cu 135 bp; banda 2, produsul ARN 18S cu 151 bp; banda 3, standardele de greutate moleculară cu 100-1000 bp; banda 4, controlul negativ cu <100 bp; banda 5, produsele ABCA1 cu 180 bp.

3.2. Evaluarea expresiei genelor în PBMC

Nivelurile de expresie ale genelor au fost măsurate în celulele mononucleare din sângele periferic și comparate între cele două grupuri prin calcularea ΔCT pentru fiecare genă. Nu a existat nicio diferență în expresia ABCA1 între cele două grupuri, dar expresia ABCG1 a fost semnificativ mai mică în grupul MetS (). Rezultatele detaliate sunt prezentate în tabelul 3.

Gena Grupuri valoare . Control Sindromul metabolic ABCA1 12.60 ± 0,60 12,19 ± 0,26 0,539 ABCG1 14,63 ± 0,60 12.98 ± 0,33 0,020

Semnificativ.

Tabel 3

Compararea CT a genelor ABCA1 și ABCG1 între cele două grupuri studiate.

De asemenea, calculul modificării fold în expresia ABCG1 () a indicat o expresie de 3,1 ori mai mică în grupul MetS.

4. Discuție

ABCA1 și ABCG1 au un rol crucial în transportul invers al colesterolului din țesuturile periferice, cum ar fi macrofagele, către ficat . Cu toate acestea, expresia genelor ABCA1 și ABCG1 a fost studiată în unele boli; nu am găsit niciun raport pe această temă în cazul sindromului metabolic. În acest studiu, am examinat expresia acestor gene la subiecții cu sindrom metabolic și la indivizi sănătoși.

În timp ce nu a existat nicio diferență semnificativă în expresia genei ABCA1 între cele două grupuri studiate, am găsit o expresie semnificativ mai mică (aproximativ 75%) a ABCG1 la subiecții cu sindrom metabolic în comparație cu grupul de control. Singaraja și colab. au arătat că reducerea ABCA1 în macrofage și rinichi este asociată cu un conținut crescut de colesterol . Ei au concluzionat că exportul afectat de colesterol mediat de ABCA1 ar putea contribui la creșterea aterosclerozei și a nefropatiei asociate cu diabetul . Există câteva rapoarte care încearcă să abordeze posibilele mecanisme care reglează expresia acestor gene. Recent, s-a demonstrat că polimorfismele în ABCA1 și ABCC8 pot fi asociate cu sindromul metabolic . Există dovezi care arată că întreruperea funcției ABCA1, care poate fi rezultatul unei mutații în această genă, poate duce la hipoalfalipoproteinemie familială care se caracterizează prin HDL scăzut și depunere crescută în esteri colesterilici în mai multe țesuturi și celule . De asemenea, s-a demonstrat că supraexprimarea genei ABCA1 poate conferi protecție împotriva aterosclerozei . Aceste date sunt în concordanță cu constatările noastre și susțin această idee că o expresie scăzută a genei ABCA1 poate contribui la complicațiile sindromului metabolic.

Haghpassand et al. au demonstrat că expresia genei ABCA1 în PBMCs are o relație directă cu încărcătura de colesterol, iar supraexprimarea ABCA1 duce la transferul excesului de colesterol către apoproteine . Wang et al. au studiat transportul invers al colesterolului la șoarecii ABCA1 și ABCG1 knock down și au concluzionat că atunci când atât ABCA1 cât și ABCG1 au fost knock down, există un transport invers al colesterolului mai mare în comparație cu ABCG1 knock down .

Din moment ce Mauerer et al. au subliniat că nivelul ridicat de glucoză (hiperglicemie) este implicat în reducerea expresiei ABCA1 și ABCG1 in vitro , pare logic să ne așteptăm la modificări similare în MetS. Promotorii ABCA1 și ABCG1 au loc de recepție pentru LXR și RXR; atunci când oxicolesterolul și acidul retinoic se alătură acestor factori, expresia ABCA1 și ABCG1 este crescută. De asemenea, cAMP și NFκB sunt factori de transcripție pentru ABCA1 și, respectiv, ABCG1.

Rezultatele obținute au indicat o scădere semnificativă a expresiei ABCG1 la pacienții cu sindrom metabolic în comparație cu persoanele sănătoase. Aceste rezultate sugerează că hiperglicemia, metaboliții asociați și hiperlipidemia peste capacitatea de transport pot duce la scăderea expresiei ABCG1. Deoarece nu s-a observat nicio modificare semnificativă în expresia genei ABCA1, aceasta se poate datora unui mecanism de reglare diferit. Deoarece structurile acestor gene sunt diferite și sunt reglementate de diverși factori transcripționali, rezultatele noastre pot fi justificate . Cu toate acestea, numărul limitat al probelor din acest studiu este un alt factor pentru absența modificărilor în expresia ABCA1.

Un alt aspect este că am examinat expresia acestor gene în PBMC ale subiecților studiați; este important de observat că modificările în expresia acestor gene în monocite pot fi diferite de cele din alte țesuturi cheie, cum ar fi ficatul și intestinul, care sunt locurile majore de sinteză a HDL. Mai mult, modificările nivelurilor ARNm nu implică neapărat modificări ale proteinelor aferente.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese.

Recunoștințe

Acest articol este extras din teza de masterat a lui Zahra Tavoosi. Autorii ar dori să mulțumească Universității de Științe Medicale din Hamadan pentru susținerea financiară a acestui studiu.

.