Farmaceutice recombinate din celule microbiene: o actualizare 2015

Fabrici de celule

De la începuturile ADN-ului recombinant, înțelegerea tot mai bună a fiziologiei celulare și a stresului, precum și a factorilor implicați în expresia heterologă a genelor și în producția de proteine a permis utilizarea diferitelor fabrici vii, și anume celule procariote și eucariote, plante sau animale. Prin utilizarea acestor sisteme, producția recombinantă rezolvă problemele de disponibilitate a surselor, este considerată un proces ecologic și biosigur și conferă capacitatea de a modifica secvențele de aminoacizi și, prin urmare, funcția proteinei, pentru a ajusta mai bine produsul la o funcție dorită . Există un spectru larg și în creștere de sisteme de expresie care devin disponibile pentru producția de proteine recombinate . Escherichia coli a fost platforma predominantă atunci când a apărut sectorul biofarmaceutic în anii 1980 și a fost urmată de implementarea drojdiei Saccharomyces cerevisiae. Ambele sisteme și metodologiile genetice asociate prezintă o versatilitate neobișnuit de mare, ceea ce le face adaptabile la diferite cerințe de producție . În ciuda explorării celulelor de insecte ca sistem de succes inițial, în special pentru proteinele orientate spre vaccinare, liniile celulare de mamifere (mai ales celulele CHO) sunt în prezent sistemul celular de origine animală predominant datorită capacității lor de a produce proteine glicozilate convenabile (Fig. 1). Capacitatea de a efectua modificări posttranslaționale contrastează cu cerințele nutriționale complexe, creșterea lentă și fragilitatea, precum și cu calendarul și costurile de producție relativ ridicate. Astfel, printre numeroasele sisteme convenționale și emergente bazate pe celule pentru producerea de proteine, bacteriile, drojdia și liniile celulare de mamifere sunt cele mai comune în biofarmacie, iar sistemele procariote și eucariote evoluează și concurează în mod constant pentru a-și îmbunătăți proprietățile și a se intensifica ca platforme de alegere pentru producerea de medicamente proteice . În timp ce bacteriile și-au pierdut rolul de lider timpuriu în acest domeniu , aproximativ 30 % din produsele biofarmaceutice comercializate sunt încă produse în acest sistem , fapt susținut de manipulabilitatea fiziologică și genetică neobișnuită a celulelor procariote .

De fapt, scopul principal în dezvoltarea de noi platforme de producție a proteinelor este de a spori funcționalitatea medicamentelor prin atingerea unei pliaje proteice și a unor modificări posttraducționale reușite, păstrând în același timp complexitatea redusă și flexibilitatea ridicată asociate culturii de celule procariote. În acest context, bacteriile Gram-pozitive, cum ar fi Bacillus megaterium și Lactococcus lactis, permit secreția eficientă a proteinelor în absența componentelor endotoxice ale peretelui celular, în timp ce ciupercile filamentoase (cum ar fi Trichoderma reesei, ), mușchiul (Physcomitrella patens, ) și protozoarele (Leishmania tarentolae, ) promovează modele de glicozilare similare cu cele din proteinele de mamifere, dar fiind în continuare cultivate prin metode mai simple decât cele cerute de celulele de mamifere. Descrieri amănunțite ale platformelor emergente (bacteriene și nebacteriene) destinate în mod specific producerii de medicamente proteice de înaltă calitate pot fi găsite în altă parte . Dezvoltarea recentă a unei tulpini de E. coli fără endotoxine și aplicarea acesteia la fabricarea proteinelor și a materialelor proteice deschide calea pentru o producție rentabilă și versatilă a proteinelor destinate utilizărilor biomedicale, prin omiterea etapelor de eliminare a endotoxinei, obținându-se astfel un câștig în materie de biosecuritate și o reducere a costurilor de producție . Să sperăm că toate aceste noi sisteme vor oferi în curând produse îmbunătățite în abordări de biofabricare încă simple și complet controlate.

Tendințe în domeniul produselor biofarmaceutice pe bază de proteine

Peste 400 de produse pe bază de proteine recombinate au fost produse cu succes și sunt aprobate ca produse biofarmaceutice , un termen care se referă la produsele terapeutice generate prin tehnologii care implică organisme vii . Alte 1300 de proteine candidate sunt în curs de dezvoltare, din care aproximativ 50 % se află în studii preclinice și alte 33 % în studii clinice (Fig. 2). În acest context, este previzibilă o creștere a numărului de aprobări în următorii ani. Dezvoltat de Eli Lilly & Co în anii ’70, Humulin, o insulină umană recombinantă fabricată în bacteria E. coli , a fost primul produs biofarmaceutic aprobat (de către FDA) în 1982 . Alte proteine naturale, cum ar fi hormonii, citokinele și anticorpii (Orthoclone OKT3) s-au numărat printre singurele nouă produse aprobate în anii 1980 (tabelul 1). În prezent, domeniile terapeutice care au beneficiat cel mai mult de produse biofarmaceutice recombinante sunt tulburările metabolice (de exemplu, diabetul de tip 1, de tip 2, obezitatea sau hipoglicemia), tulburările hematologice (de exemplu, anemia renală, hemofilia A, tulburările de sângerare sau de coagulare) și oncologia (de exemplu, melanomul, cancerul mamar sau colorectal), cu 24, 18 și, respectiv, 15 % din aprobări (Fig. 3). În această privință, oncologia este o piață în expansiune evidentă. În perioada 2010-2014, 9 din cele 54 de produse biofarmaceutice aprobate au fost medicamente antitumorale, cancerul reprezentând cea mai frecventă indicație în această perioadă. Săpând în bazele moleculare ale produselor biofarmaceutice, există o tendință clară către produsele pe bază de anticorpi. În aceeași perioadă (2010-2014), 17 din cele 54 de medicamente proteice aprobate au fost anticorpi monoclonali (31,5 %), în comparație cu 11 % în perioada 1980-1989 . Mai mult, printre cele mai bine vândute zece produse biofarmaceutice proteice la nivel mondial în 2014 (tabelul 2), șase sunt anticorpi sau proteine derivate din anticorpi (Humira, Remicade, Rituxan, Enbrel, Avastin, Herceptin; http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/).

Anterior, produsele biofarmaceutice erau versiuni recombinante ale proteinelor naturale, cu aceeași secvență de aminoacizi ca și versiunile native respective (cu doar modificări minore, adesea rezultate din strategia de clonare). Începând cu anii 1990, o proporție semnificativă a aprobărilor se bazează pe forme foarte modificate de proteine recombinate. Această alternativă nouă, bazată pe fuziunea proteinelor sau a domeniilor și pe versiuni trunchiate, oferă un spectru larg de combinații posibile pentru a obține noi produse biofarmaceutice cu diferite activități îmbinate, care nu se găsesc împreună în natură.

Farmaci proteice pentru tratamentul cancerului

Oncologia este una dintre indicațiile terapeutice care domină piața biofarmaceutică, deoarece cancerul este o cauză majoră de morbiditate și mortalitate la nivel mondial. Chirurgia și radioterapia sunt eficiente în vindecarea cancerului în stadii incipiente ale bolii; cu toate acestea, ele nu pot eradica boala metastatică. Prezența micrometastazelor sau a metastazelor evidente clinic la diagnosticare necesită utilizarea acestora în combinație cu chimioterapia genotoxică pentru a crește ratele de vindecare . Cu toate acestea, succesul chimioterapiei a fost îngreunat din cauza lipsei de selectivitate și specificitate, astfel încât toxicitatea asupra țesuturilor normale limitează doza care ar putea fi administrată pacienților. Dezvoltarea de produse biofarmaceutice capabile să inhibe ținte moleculare specifice care conduc cancerul (de exemplu, anticorpii monoclonali anti-Her2-Trastuzumab- sau anti-VEGF-Bevacizumab-) merge în această direcție .

Printre produsele biofarmaceutice proteice comercializate, aproape 24 % (94 de produse) sunt utilizate în terapii antitumorale. Cele mai multe dintre aceste produse sunt utilizate în scopuri de susținere menite să minimizeze efectele secundare ale chimioterapiei, de obicei neutropenia sau anemia (câteva exemple reprezentative sunt prezentate în tabelul 3). Nouăsprezece din aceste 94 de produse sunt adevărate medicamente antitumorale, dintre care 69 % sunt produse în E. coli (Fig. 4) și se bazează pe secvențe aminoacidice proiectate, fuziuni proteice și domenii proteice unice (tabelul 4).

Clar, versiunile proteice modificate sunt cele mai abundente în terapiile împotriva cancerului față de polipeptidele naturale. Ca exemple relevante, Ziv aflibercept este o proteină de fuziune recombinantă produsă în celule CHO utilizată împotriva cancerului colorectal. Aceasta constă în porțiuni din fiecare dintre receptorii factorului de creștere endotelială vasculară (VEGFR1 și VEGFR2) fuzionate cu fracțiunea constantă (Fc) a unei imunoglobuline umane IgG1 (Fig. 5). Această construcție acționează ca o momeală prin legarea la VEGF-A, VEGF-B și la factorul de creștere placentară (PlGF), care activează VEGFR. Această capcană împiedică interacțiunea dintre factorii de creștere și receptori, inhibând calea VEGF, care este implicată în procesul angiogenic . Denileukin diftitox este o proteină recombinantă compusă din două fragmente de toxină difterică (A și B) și o interleukină-2 umană (Fig. 5). Toxina difterică este o exotoxină puternică secretată de Corynebacterium diphteriae. Datorită structurii sale particulare, întregul complex, produs în E. coli, este capabil să livreze un agent citotoxic direct la o țintă specifică. Există două blocuri active principale a căror funcție este, în primul rând, de a furniza selectiv produsul biofarmaceutic (IL-2) și, în al doilea rând, de a provoca citotoxicitate (toxina A și B) . Proteina de fuziune se leagă de receptorul IL-2, care este exprimat în celulele canceroase (limfom cutanat cu celule T). Odată ce fracțiunea de toxină este internalizată, domeniul catalitic promovează moartea celulară prin inhibarea sintezei proteice .

Deoarece administrarea de medicamente țintite pentru cancer este un domeniu de cercetare cel mai recent și în expansiune, alte produse biofarmaceutice nerecombinante, pe bază de proteine, sunt, de asemenea, puternic reprezentate. Acestea includ în principal conjugate anticorp-medicament (ADC), cum ar fi Brentuximab vedotin, Trastuzumab emtansine, sau conjugate nanoparticule-medicament, cum ar fi nab-paclitaxel . În aceste cazuri, omologul proteic acționează ca un vehicul țintit pentru medicamentele chimice convenționale. Din nou, această abordare urmărește livrarea selectivă a medicamentului către celule țintă specifice, cu scopul de a crește activitatea antitumorală, reducând în același timp toxicitatea asupra celulelor normale și efectele secundare asociate.

Produsele împotriva cancerului care au furnizat cele mai mari venituri în 2013 sunt reprezentate în Fig. 6. Șaizeci la sută dintre aceste produse sunt proteine recombinante, ceea ce susține ideea că producția de proteine recombinante este încă o platformă în ascensiune și promițătoare, oferind loc pentru progrese importante în sectorul biofarmaceutic.

.