Frontiers in Microbiology

Introducere

Bacteriofagii au intrat în atenția cercetării științifice, deoarece joacă un rol important în aproape toate comunitățile microbiene. Ca prădători virali ai bacteriilor, ei au o influență substanțială asupra populațiilor microbiene și a dinamicii acestora în diferite medii. Există mai multe recenzii care se ocupă de rolul bacteriofagilor în diferite habitate, cum ar fi mările sau corpul uman (Clokie și Mann, 2006; Wahida et al., 2016; Łusiak-Szelachowska et al., 2017). De la descoperirea lor în urmă cu peste 100 de ani, separat de Frederick Twort și apoi de Felix D’Herelle (Salmond și Fineran, 2015), bacteriofagii au fost utilizați în țările din Europa de Est pentru tratamentul medical al infecțiilor bacteriene, în timp ce în restul lumii antibioticele au fost protagonistele (Myelnikov, 2018). În prezent, deoarece infecțiile cu bacterii multirezistente au devenit o amenințare la nivel mondial (Zaman et al., 2017), pacienții din întreaga lume sunt tratați la Institutul Eliava de bacteriofagi, microbiologie și virusologie din Tbilisi, Georgia, care are probabil cea mai lungă experiență în terapia cu bacteriofagi (Kutateladze și Adamia, 2008), precum și în Unitatea de terapie cu bacteriofagi a Institutului Ludwik Hirszfeld de imunologie și terapie experimentală din Wrocław, Polonia (Międzybrodzki et al., 2012). Aplicarea bacteriofagilor ar putea fi o soluție valoroasă nu numai în sectorul medical, ci și în alte domenii în care bacteriile pot avea un impact negativ.

Câteva companii din Statele Unite, cum ar fi OmniLytics Inc. (Sandy, UT, Statele Unite) și Intralytix Inc. (Baltimore, MD, Statele Unite) au dezvoltat diferite produse bacteriofage pentru aplicarea ca dezinfectanți în industria alimentară, care pot fi utilizate împotriva Salmonella, Escherichia coli și Listeria monocytogenes. În Europa, o companie olandeză Micreos BV (Wageningen, Țările de Jos) a comercializat, de asemenea, produse bacteriofage împotriva Salmonella și E. coli, iar o companie germană, Fink Tec (Hamm, Germania), care vizează E. coli (Moye et al., 2018). Se așteaptă o aplicare mai largă a bacteriofagilor în lanțul valoric alimentar, inclusiv în agricultură și acvacultură, unde un spectru larg de diverși agenți patogeni ai plantelor și peștilor cauzează pierderi economice semnificative (Buttimer et al., 2017; Doss et al., 2017).

Deși unele produse bacteriofage sunt deja comercializate, un proces eficient, constant și controlabil pentru producția de bacteriofagi nu a fost încă realizat. Producția de fagi în laboratoare poate fi considerată un proces de rutină, iar protocoalele sunt bine definite; cu toate acestea, aceste procese nu sunt ușor de extins la scară largă. Entitățile industriale au interesul principal de a obține metode fiabile de producere a fagilor care să permită extinderea procesului. Cu toate acestea, soluția nu este ușoară, din cauza naturii biologice a sistemului și a diverselor tipuri de interacțiuni care au loc între fagi și bacterii.

Au existat mai multe încercări de a genera metode fiabile pentru producția de bacteriofagi. Unii cercetători au folosit o abordare teoretică cu modele de simulare, în timp ce alții au adoptat o abordare practică prin experimente. Această mini-revizuire examinează exemple selectate ale ambelor abordări, contrastând principalele lor diferențe.

Generalități în producția de bacteriofagi

Natura biologică a bacteriofagilor forțează reproducerea lor în celula gazdă. Prin urmare, o metodă de producere a bacteriofagilor necesită un proces de producție care să implice cel puțin două unități operaționale, creșterea bacteriei gazdă și propagarea (sau infectarea) bacteriofagului. Este important să se ia în considerare parametrii de bază pentru creșterea bacteriei și infectarea fagilor, cum ar fi substraturile selectate pentru bacterie și temperatura optimă, atât pentru creșterea bacteriei, cât și pentru infectarea fagilor, deoarece acești factori pot influența infectivitatea fagilor (Tokman et al., 2016). În mod similar, este important să se cunoască biologia fagului care urmează să fie produs, inclusiv diferiții parametri de infecție, cum ar fi rata de adsorbție, dimensiunea exploziei și perioada de latență; cu toate acestea, după cum se va discuta ulterior, acești parametri se pot modifica în funcție de condițiile de infecție (Santos et al., 2014). Mai important, se recomandă o înțelegere profundă a interacțiunilor specifice care pot apărea între gazda bacteriană și fagul selectat, cum ar fi prezența unui sistem CRISPR-cas în bacterie, deoarece acești factori pot avea o influență puternică asupra procesului de infectare a fagului (Levin et al., 2013). De asemenea, se recomandă să se selecteze ca gazdă o tulpină bacteriană nevirulentă. Producția de bacteriofagi la nivel industrial va necesita cantități mari de bacterie gazdă, astfel încât evitarea utilizării agenților patogeni virulenți rezistenți la medicamente și, în special, multirezistenți ar trebui să fie obligatorie într-un proces de producție de fagi (Torres-Barceló, 2018). Același lucru este valabil și pentru bacteriile purtătoare de profagi, deoarece acestea ar putea fi induse în timpul procesului, modificând rezultatul final (Stewart și Levin, 1984).

Un proces fiabil pentru producția de bacteriofagi pe scară largă poate fi foarte evaziv, deoarece datele obținute într-un laborator nu sunt întotdeauna utile pentru extinderea proceselor biologice (Kwok, 2010). Cercetătorii au încercat să umple această lacună în principal prin studii privind producția de bacteriofagi bazate pe simulări pe calculator, unele dintre ele validate experimental. Aici, vom analiza mai întâi studiile teoretice axate pe modelele de producere a fagilor și apoi studiile selectate care au fost validate experimental. Toate cazurile sunt în concordanță cu criteriile de testare pentru purificarea și validarea ulterioară a unui produs pe bază de bacteriofag, iar unele dintre ele sunt incluse în ambele secțiuni (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018a).

Modele teoretice pentru producția de bacteriofagi

Pentru a descrie un proces de producție de fagi printr-un model matematic este important să se definească parametrii cinetici care trebuie incluși în model. Cei trei parametri de bază pentru producția de fagi sunt populațiile de bacterii neinfectate sensibile, bacteriile infectate cu fagi și fagii liberi (Krysiak-Baltyn et al., 2016). Pornind de aici, diferite modele au inclus variabile suplimentare, cum ar fi bacteriile neinfectate rezistente (Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018) sau mai multe specii bacteriene (Levin et al., 1977). Toate aceste populații interacționează controlate de parametrii cinetici asociați cu creșterea bacteriană și infecția cu fagi. Se consideră că sunt bine cunoscute constantele care sunt importante pentru bacterii; cu toate acestea, acest lucru este încă în discuție pentru bacteriofagi. Există un consens asupra faptului că constanta de adsorbție, perioada de latență și mărimea exploziei sunt variabile importante de luat în considerare; cu toate acestea, relevanța lor în model variază între diferite studii. În plus, diferiți autori folosesc nomenclaturi diferite pentru a defini parametrii cinetici, ceea ce reprezintă una dintre principalele dificultăți în stabilirea de comparații între diferite modele și în unificarea cunoștințelor generale pe această temă. De exemplu, rata de adsorbție a fagilor (indicatorul particulelor de fag adsorbite pe bacterii) este denumită în mod obișnuit prin simbolul „δ”; cu toate acestea, Beretta și Kuang (1998) au folosit simbolul „K”, care poate fi, de asemenea, simbolul pentru constanta lui Monod de specificitate a substratului „Ks”. Alte exemple de nomenclatură diferită pot fi găsite în tabelul 1. Ca și în cazul altor procese biologice, este de așteptat ca autorii care lucrează în domeniul modelelor de creștere a fagilor-bacteriilor să convină asupra unui vocabular algebric specific sau să includă o explicație clară a termenilor și unităților în articolele lor și o nomenclatură clară, așa cum au afirmat recent Krysiak-Baltyn et al. (2018). Pe baza nomenclaturii utilizate de alți autori (Tabelul 1), propunem utilizarea caracterelor grecești pentru a denumi diferiți parametri cinetici în reproducerea fagilor. Mărimea exploziei poate fi simbolizată prin β, rata de adsorbție prin δ, timpul de eclipsă prin ε și rata de dezintegrare a fagului prin λ. Singurele excepții ar fi concentrația de fag, care este cunoscută în mod obișnuit ca „P”, și timpul de latență, cunoscut ca „L”. Uniformitatea acestui limbaj matematic va facilita înțelegerea și extragerea datelor pentru viitorii recenzenți din mediul academic sau din industrie.

Începând cu Campbell (1961), au fost făcute multe eforturi pentru a descrie modele de producere a bacteriofagilor, descriind comportamentul populației de fagi în mai multe condiții și metode. Tabelul 1 rezumă diferite modele de producere a fagilor, prezentate sub formă de ecuații diferențiale sau integrale (în funcție de decizia fiecărui autor), menționând considerații specifice pentru fiecare model.

Modelurile de producere a fagilor sunt, în general, consecvente în descrierea modificărilor populației de fagi în timp. Aceasta poate fi reprezentată ca o schimbare cinetică a particulelor de fagi sau a unităților formatoare de plăci (PFU) pe unitate de timp, a concentrațiilor finale obținute după un proces discontinuu sau în timpul unei perioade de timp într-un proces continuu. În ciuda consensului general, aceste modele diferă în mai multe afirmații. Modelele propuse de Campbell (1961) și Beretta și Kuang (1998) sunt consecvente în ceea ce privește echilibrarea particulelor de fag cu termeni de generare (eliberarea de particule de bacteriofag pe unitate de timp) și pierderea bacteriofagului liber din cauza ratelor de adsorbție sau de descompunere; aceste modele sunt utile datorită simplității lor și a utilizării parametrilor standard de creștere a fagilor, cum ar fi rata de adsorbție, dimensiunea exploziei și timpul de latență, și reprezintă o modalitate rapidă de a simula procesele de producție discontinue, dar nu s-au putut adapta la procese precum populațiile de bacterii rezistente sau evoluția fagilor în timp. De asemenea, aceste modele tind să subestimeze influența unor parametri precum mărimea burstului și perioada de latență, în timp ce modele mai recente au arătat importanța acestor parametri și modul în care pot varia în funcție de alți factori (Santos et al., 2014; Nabergoj et al., 2018b).

Un model interesant propus recent de Santos et al. (2014) ia în considerare influența ratei de creștere bacteriană asupra constantei de adsorbție a fagilor și o ecuație de distribuție normală care reglementează valorile perioadei de latență, luând în considerare variabilitatea acestor parametri. Acest model s-a dovedit a fi foarte util, deoarece oferă posibilitatea de a evalua influența substratului în producția de fagi, iar includerea ratei de creștere bacteriană în model oferă un instrument indirect pentru a lua în considerare starea fiziologică a bacteriilor în timpul procesului. Dependența parametrilor de infectare a bacteriofagilor de rata de creștere bacteriană a fost explorată ulterior și de alți autori (Krysiak-Baltyn et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b); Nabergoj și colegii au constatat că dimensiunea exploziei a crescut liniar cu rata de creștere bacteriană, în timp ce constanta de adsorbție și perioada de latență au scăzut.

Alte modele au explorat influența mai multor specii bacteriene, precum și apariția rezistenței bacteriene (Levin et al., 1977; Santos et al., 2014; Chaudhry et al., 2018). Deși scopul acestor studii nu a fost întotdeauna acela de a dezvolta metode de producere a fagilor, ele sunt utile pentru a descrie situațiile potențiale care pot apărea în timpul procesului. Aceste modele includ variabile asociate cu selecția rezistenței bacteriene și cu ratele de reversie în funcție de populația bacteriană (disponibilitatea unor bacterii mai puțin sau mai sensibile în timp), definind condițiile în care bacteriile sensibile și rezistente pot coexista, cum ar fi un dezavantaj selectiv puternic în cazul bacteriilor rezistente (de exemplu, o rată de creștere mai mică) și/sau existența unui refugiu spațial (sau a unui refugiu de densitate) în care (sub care) fagul nu este capabil să infecteze bacteriile. Chaudhry et al. (2018) au oferit o explicație interesantă a modului în care fagii pot persista în populații dominate de bacterii rezistente, sugerând că acestea din urmă ar putea produce bacterii susceptibile la frecvențe care ar permite replicarea fagilor. Este interesant faptul că acest fenomen a fost sugerat anterior (Bastías et al., 2010). Generarea de tulpini rezistente la fagi în sistemele de producere a fagilor ar putea fi un motiv de îngrijorare și, prin urmare, ar trebui să fie inclusă în dezvoltarea de noi metode, pentru a minimiza această posibilitate. Mai mulți autori au sugerat că această problemă poate fi evitată cu ajutorul configurației de producție a fagilor, care va fi discutată în secțiunea următoare.

Un alt studiu interesant este cel al lui Krysiak-Baltyn et al. (2018), care încorporează, de asemenea, parametrii de infecție variabili în funcție de rata de creștere bacteriană și estimează costul operațional și productivitatea într-un sistem de proces simulat în două etape. Una dintre concluziile importante ale acestui studiu teoretic este că concentrația optimă de substrat pentru creșterea bacteriilor nu ar trebui să fie neapărat aceeași pentru producția de bacteriofagi, iar conform analizei lor, costul pe ml de fagi la o concentrație de 4 × 1010 fagi/mL ar putea fi de doar 1,78 × 10-2 dolari. Ar fi interesant să avem o validare experimentală a acestei estimări și să determinăm modul în care se adaptează la diferite economii sau țări.

În cele din urmă, evoluția bacteriofagilor trebuie să fie luată în considerare și într-un proces de producție, deoarece fagii ar putea să își mărească sau să își diminueze eficiența de a infecta bacteriile în timp (Lenski și Levin, 1985). Acest concept ar putea fi reprezentat ca rate de infecție în experimentele privind gama de gazde, unde chiar și metodele de extindere a gamei de gazde pot fi realizate pentru aplicații de fagoterapie (Mapes et al., 2016). Această situație a fost simulată în culturile discontinue, demonstrându-se că apariția mutanților fagi depinde în mare măsură de flexibilitatea genetică a fagilor (ratele de mutații) (Levin și Bull, 2004). Capacitatea de a prezice evoluția fagilor în timpul producției ar fi utilă pentru a configura un proces de producție care să minimizeze probabilitatea de modificare a proprietăților litice ale fagilor. Articolele analizate arată că modelele de producere a bacteriofagilor sunt o abordare importantă care poate ajuta la găsirea celor mai bune strategii, însă acestea trebuie validate experimental.

Experiențe experimentale în producția de bacteriofagi

Există mai multe studii practice care implică producția de fagi. Unele sunt axate pe producția de fagi în bioreactoare, în timp ce altele se concentrează pe evaluarea și optimizarea procesului. După cum era de așteptat, aceste experiențe iau în considerare, de asemenea, o etapă de creștere bacteriană și infectare/propagare a fagilor în flacoane și bioreactoare (tabelul 2). Aceste date sunt utile pentru a oferi informații cu privire la modul în care anumite modele de gazdă-bacteriofag pot fi utilizate pentru propagare și creșterea nivelurilor de producție de fagi. Cele mai frecvente sisteme gazdă-fagiu utilizate sunt tulpinile de E. coli și fagii acestora, probabil datorită cantității de informații referitoare la aceste sisteme bacterie-fagiu (fagii E. coli T3, T4 și T7) și a lipsei de informații privind alte sisteme bacterie-fagiu.

Potrivit unui caz raportat, titrurile obținute pot fi de până la 1,2 × 1016 PFU mL-1 într-un bioreactor discontinuu (5 L) (Sochocka et al., 2015). Acest nivel de producție este în concordanță cu producția necesară în scopuri terapeutice (>1 1010 PFU mL-1), având în vedere etapele de purificare, rata de descompunere a fagilor și stabilitatea sau durata de conservare (Naghizadeh et al., 2018). Alți autori au raportat, de asemenea, niveluri promițătoare de producție de 5 × 1012 PFU mL-1 în 1,2 L (Warner et al., 2014) și 2,4 × 1013 PFU zi-1 în 1 L (Nabergoj et al., 2018a; Tabelul 2).

Este dificil să se stabilească comparații cu privire la ce metodă ar putea fi mai eficientă, deoarece acestea utilizează proceduri de cultură diferite și sisteme gazdă-bacteriofag diferite. Cultura discontinuă este cea mai ieftină (nu cea mai simplă) modalitate de producere a bacteriofagilor, dar este foarte limitată de volumul maxim al echipamentului disponibil, de timpul total de funcționare și de disponibilitatea substratului (concentrațiile mai mari pot fi inhibitorii pentru creșterea bacteriilor). Cultura continuă are o scalabilitate mai mare atunci când se optimizează rata de diluție bacteriană prin modificarea fluxului de intrare și de ieșire. În plus, reglarea ratei de diluție va permite un control direct asupra ratei de creștere bacteriană, care are o influență directă asupra parametrilor de infecție, cum ar fi dimensiunea exploziei, constanta de adsorbție și perioada de latență (Mancuso et al., 2018; Nabergoj et al., 2018b). Rata de diluție poate fi, de asemenea, utilizată pentru a crește productivitatea sistemului, după cum au demonstrat Nabergoj et al. (2018a), unde s-a obținut o productivitate maximă a fagilor de 109 faguri mL-1 h-1 cu o rată de diluție scăzută de 2 h-1 într-un sistem cellstat de 1 L. Un sistem de funcționare continuă poate fi permanent operațional și, prin urmare, este cel mai convenabil mod de a produce un produs biotehnologic pentru o companie. Cu toate acestea, ele sunt greu și costisitor de implementat, necesitând o monitorizare constantă pentru a menține starea de echilibru. Un proces complet continuu pentru creșterea bacteriilor și producția de bacteriofagi ar putea crește probabilitatea apariției rezistenței bacteriofagilor dacă nu se adoptă contramăsuri specifice (Middelboe et al., 2001).

Câțiva autori au sugerat implementarea unor procese în două etape, una exclusiv pentru producția de bacterii și o a doua pentru propagarea fagilor (Schwienhorst et al., 1996; Sauvageau și Cooper, 2010; Nabergoj et al., 2018a). Acest lucru poate fi realizat cu un sistem cellstat, în care două bioreactoare sunt conectate în serie cu un flux constant prin sistem. În acest caz, debitul dintre reactoare și volumul din fiecare reactor (precum și rata de diluție și rata de creștere bacteriană prin adaos) pot fi controlate pentru a atinge productivitatea maximă (Nabergoj et al., 2018a). O altă configurație interesantă propusă de Sauvageau și Cooper (2010) constă într-un sistem semicontinuu al unui proces în două etape, cu autociclare. În acest caz, fiecare etapă funcționează în mod similar cu o cultură discontinuă, în care bacteriile sunt mai întâi cultivate separat de fag și apoi sunt introduse în etapa de propagare a fagului atunci când este atinsă o concentrație adecvată, permițând astfel inițierea procesului de infectare utilizând o multiplicitate dorită a infecției (Kasman et al., 2002). Această configurație are, de asemenea, avantajul de a nu necesita o monitorizare permanentă pentru a menține starea de echilibru a sistemelor continue și a fost utilizată pentru a obține o productivitate de 7,59 × 1014 PFU mol CO2-1 (Sauvageau și Cooper, 2010). Ambele exemple, sistemul cellstat și procesul de autociclare în două etape, au marele avantaj că bacteriile sunt cultivate în absența fagilor, prin urmare rezistența la bacteriofagi nu este favorizată în timpul procesului.

În cele din urmă, este important de remarcat faptul că există unii parametri care nu sunt întotdeauna raportați în studiile despre producția de bacteriofagi. De exemplu, parametrii precum proporția de aerare sau debitul de aer în bioreactor sunt menționați doar în două rapoarte (Sauvageau și Cooper, 2010; Santos et al., 2014), deși acesta este unul dintre cei mai importanți parametri în producția de bacteriofagei la nivel industrial. Informațiile despre alți parametri, cum ar fi transferul de energie, utilizarea diferită a substraturilor, designul bioreactorului, agitația, elicele și materialele de construcție în producția de bacteriofagi sunt puține sau inexistente.

Concluzie finală

Redescoperirea utilizării potențiale a fagilor într-un spectru larg de aplicații este foarte interesantă și promițătoare. Dovezile sugerează că ar trebui să fie preferate sistemele de producere a bacteriofagilor care reduc probabilitatea apariției rezistenței bacteriofagilor, cum ar fi un stadiu celular sau un proces de autociclare în două etape. Aceste opțiuni ar permite, de asemenea, controlul variabilelor pentru a crește productivitatea procesului. Cu toate acestea, modelele de producere a bacteriofagilor sunt departe de a fi stabilite și pot fi îmbunătățite în mai multe moduri. Există încă multe provocări care trebuie depășite. Sunt necesare studii suplimentare privind producția optimizată de bacteriofagi la scară largă, costurile infrastructurii și ale echipamentelor, diferite preocupări legate de siguranță și dozajul aplicației, iar experiența sugerează că aceste provocări ar trebui să fie abordate prin eforturi de colaborare ale partenerilor academici și industriali.

În cele din urmă, este important de remarcat faptul că majoritatea modelelor pentru producția de bacteriofagi pot fi aplicate într-un anumit interval de valori pentru parametrii de infectare a fagilor și de creștere bacteriană. Prin urmare, indiferent de progresele importante în modelele și configurațiile de producere a fagilor, cunoașterea profundă a sistemului specific fag-bacterie va fi întotdeauna prima cerință pentru a stabili un sistem eficient de producere a fagilor.

Contribuții ale autorilor

RG, SL și RB au conceput lucrarea și au scris manuscrisul. KG, GH și JR au scris secțiunile manuscrisului. Toți autorii au contribuit la revizuirea bibliografică, la revizuirea manuscrisului, au citit și au aprobat versiunea trimisă.

Finanțare

Această lucrare a fost finanțată de CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133 și Postdoctorado PUCV 2018.

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.

Recunoștințe

RG mulțumește CONICYT PFCHA DOCTORADO/2016 21161133. SL mulțumește Postdoctorado PUCV 2018.

.