Potențiala utilizare a celulelor stem pluripotente induse (iPSC) în aplicații personalizate de medicină regenerativă poate fi sporită prin transgenie, inclusiv exprimarea etichetelor celulare constitutive, a markerilor de diferențiere sau a modulatorilor de fenotipuri de boală. Astfel, există un precedent pentru exprimarea reproductibilă a transgenei între subclonele iPSC cu medii genetice izogene sau diverse. Utilizând vectori virali sau transpozoni, locurile de integrare a transgenei și numărul de copii sunt dificil de controlat și aproape imposibil de reprodus între mai multe linii celulare. În plus, transgenele integrate aleatoriu sunt adesea supuse unor efecte pleiotropice de poziție ca urmare a modificărilor epigenetice inerente diferențierii, ceea ce subminează aplicațiile în iPSC. Pentru a rezolva această problemă, am adaptat tehnologiile populare de nuclează TALEN și CRISPR/Cas9 pentru a introduce transgene în loci predefiniți și pentru a depăși efectele de poziție aleatoare. AAVS1 este un locus exemplar în cadrul genei PPP1R12C care permite o expresie robustă a transgenelor conduse de promotorul CAG. Direcționarea genei controlează numărul de copii ale transgenei astfel încât modelele de expresie a reporterilor sunt reproductibile și scalabile de ∼2 ori. În plus, expresia genei este menținută în timpul culturii iPSC umane pe termen lung și al diferențierii in vitro de-a lungul mai multor linii genetice. Aici, prezentăm protocolul nostru de direcționare AAVS1 folosind vectori donatori standardizați și metode de construcție, precum și oferim considerații practice pentru cultura iPSC, selecția medicamentelor și genotiparea.
.