Interacțiunea 4-1BB/4-1BBL promovează inflamația adipoasă indusă de obezitate prin declanșarea semnalizării inflamatorii bidirecționale în adipocite / macrofage

Abstract

Inflamația adipoasă indusă de obezitate se caracterizează prin recrutarea de macrofage în țesutul adipos și eliberarea de citokine inflamatorii. 4-1BB, un receptor costimulator, modulează procesele inflamatorii prin interacțiunea cu ligandul său 4-1BBL pe suprafețele celulelor imune. În acest studiu, am examinat dacă o interacțiune 4-1BB/4-1BBL între adipocite și macrofage participă la inflamația adipoasă indusă de obezitate. Am constatat că 4-1BB a fost exprimat pe adipocite și a fost suprareglementat de factorii legați de obezitate, ceea ce a sporit, de asemenea, expresia 4-1BBL pe macrofage. Agoniștii 4-1BB și/sau 4-1BBL, respectiv 4-1BBL, au activat moleculele de semnalizare inflamatorie (MAPK/IκBα și MAPK/Akt) în adipocite și macrofage și au sporit eliberarea de citokine inflamatorii (MCP-1, TNF-α și IL-6). Mai mult decât atât, întreruperea interacțiunii 4-1BB/4-1BBL a diminuat eliberarea de citokine inflamatorii din adipocite/macrofage de contact cocultivate. Aceste constatări indică faptul că semnalizarea bidirecțională mediată de 4-1BB/4-1BBL în adipocite/macrofage promovează inflamația adipoasă. 4-1BB și 4-1BBL pot fi ținte utile pentru protecția împotriva inflamației adipoase induse de obezitate.

1. Introducere

Inflamația indusă de obezitate este considerată a fi o cauză potențială a tulburărilor metabolice, cum ar fi rezistența la insulină, diabetul de tip 2 și bolile cardiovasculare . Țesutul adipos participă activ la inflamația indusă de obezitate prin recrutarea macrofagelor și a celulelor T și eliberarea de citokine inflamatorii (monocyte chemotactic protein-1, MCP-1; tumor necrosis factor alpha, TNF-α; interleukina-6, IL-6) care modulează diferențierea adipocitelor, metabolismul și răspunsurile inflamatorii locale/sistemice, provocând dezechilibre metabolice nedorite . În mod interesant, studii recente au arătat că cocultura prin contact direct a adipocitelor și a macrofagelor are ca rezultat o eliberare marcat crescută de citokine inflamatorii , ceea ce indică faptul că interacțiunea dintre moleculele de suprafață celulară de pe aceste celule este importantă pentru promovarea răspunsurilor inflamatorii ale acestora.

4-1BB (cunoscut și sub numele de CD137 și TNFRSF9) este un exemplu clasic de moleculă costimulatoare și un receptor inflamator bine cunoscut care este exprimat de celulele T activate la locurile de inflamație . Stimularea 4-1BB pe celulele T duce la expansiunea celulară, la producerea de citokine și la dezvoltarea funcțiilor efectoare citolitice . Ligandul 4-1BB (4-1BBL, cunoscut și sub numele de CD137L și TNFSF9) este foarte bine exprimat de majoritatea celulelor imune și de multe celule neimune și poate primi și transmite semnale inverse în celule precum macrofagele . Dovezile acumulate arată că interacțiunile bidirecționale de suprafață celulară 4-1BB/4-1BBL în celulele imune sunt esențiale în inițierea și modularea diferitelor răspunsuri inflamatorii (de exemplu, artrita reumatoidă, miocardita autoimună și tumorile hematologice maligne) . Mai mult, interacțiunile mediate de 4-1BB/4-1BBL apar, de asemenea, între celulele imune și cele neimune, influențând din nou răspunsurile inflamatorii. De exemplu, interacțiunea dintre 4-1BB și 4-1BBL pe celulele endoteliale și macrofage este implicată în inflamația vasculară , iar interacțiunea dintre cele două molecule pe celulele epiteliale și celulele natural killer este implicată în leziunile de ischemie-reperfuzie renală . Am arătat anterior că expresia 4-1BB și 4-1BBL a fost crescută în țesutul adipos inflamat din cauza obezității și că ablația 4-1BB a redus inflamația adipoasă . Prin urmare, am emis ipoteza că interacțiunea dintre 4-1BB și 4-1BBL pe celulele adipoase și celulele imune, cum ar fi macrofagele, joacă un rol în inflamația adipoasă în obezitate.

În acest studiu, arătăm pentru prima dată că 4-1BB este exprimat pe adipocite și este crescut de factori legați de obezitate și demonstrăm că semnalizarea bidirecțională mediată de 4-1BB/4-1BBL în adipocite/macrofage joacă un rol crucial în inițierea și promovarea cascadei inflamatorii adipoase induse de obezitate.

2. Materiale și metode

2.1. Animale

Soarecii C57BL/6 (masculi, în vârstă de 8 săptămâni) (Orient Ltd., Busan, Coreea) au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (HFD, 60% din calorii din grăsimi (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, SUA); șoareci obezi) sau cu o dietă săracă în grăsimi (LFD; 10% din calorii din grăsimi (Research Diets); șoareci neobezi) timp de 9 săptămâni. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de comitetul de etică animală al Universității din Ulsan și au fost conforme cu orientările National Institutes of Health.

2.2. Anticorpi

Soarecii nud au fost amorsați cu pristane și injectați intraperitoneal cu un hibridom subclonat care produce un anticorp monoclonal (Ab) agonist împotriva 4-1BB (3E1) pentru a induce formarea de ascită . Ab monoclonal a fost purificat din lichidul de ascită prin cromatografie pe coloană de afinitate cu proteină G-Sepharose (Sigma-Aldrich). Fc 4-1BB recombinant (r4-1BB Fc) a fost achiziționat de la Adipogen (Seul, Coreea). Ab monoclonal antagonist împotriva 4-1BBL (TKS-1) a fost achiziționat de la e-Bioscience (San Diego, CA, SUA). Imunoglobulina G de șobolan (IgG de șobolan) și IgG1 umană au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SUA) și utilizate ca martor.

2.3. Culturi celulare și tratamente

Linia celulară de macrofage murine Raw264.7 a fost obținută de la Korean Cell Line Bank (KCLB40071, Seul, Coreea). Această linie celulară a fost menținută în RPMI1640 (Gibco BRL, NY, SUA) care conține 10% (vol/vol) FBS (ser fetal bovin) (Gibco BRL, NY, SUA) și a fost incubată la 37°C în mediu umidificat cu 5% CO2. Preadipocitele 3T3-L1 au fost menținute în DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) cu conținut ridicat de glucoză (Gibco BRL, NY, SUA) conținând 10% FBS. Preadipocitele 3T3-L1 confluente (ziua 0) au fost incubate în DMEM care conținea 10 μg/mL insulină (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (dexametazonă, Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (3-izobutil-1-metil-xantină, Sigma-Aldrich) și 10% FBS timp de 2 zile. Pe scurt, celulele 3T3-L1 au fost diferențiate în adipocite mature prin incubare în DMEM cu 10% FBS și 5 μg/mL insulină timp de 2 zile. Adipocitele mature au fost menținute în acest mediu, iar mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu proaspăt la fiecare 2 zile. Acidul gras liber (FFA, amestec de acid palmitic, Sigma-Aldrich) a fost dizolvat în etanol care conține albumină serică bovină (BSA, 25 μM) și conjugat cu BSA la un raport molar de 10 : 1 înainte de utilizare. Adipocitele 3T3-L1 (3 × 105 celule/poci) sau macrofagele Raw264.7 (3 × 105 celule/poci) în plăci cu 24 de puțuri, au fost tratate cu factori legați de obezitate (acid palmitic : pal, lipopolizaharidă : LPS) timp de 24 h sau, respectiv, 4 h. Pentru a stimula 4-1BB pe adipocite, adipocitele 3T3-L1 pe plăci cu 24 de godeuri au fost incubate cu 4-1BB Ab agonist (3E1, 1 μg/mL) sau IgG de șobolan timp de 48 h în mediu fără ser. Pentru a imobiliza r4-1BB Fc sau IgG1 uman pe plăcile de cultură, r4-1BB Fc sau IgG1 uman au fost incubate în plăci cu 24 de godeuri la 37°C timp de 1 h într-un incubator cu CO2, iar godeurile au fost clătite cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS). Plăcile au fost apoi incubate cu RPMI (10% FBS) la 37°C timp de 1 h într-un incubator cu CO2, iar godeurile au fost clătite cu PBS. Macrofagele Raw264.7 au fost incubate la 5 × 105 celule/poț în plăci cu fund plat cu 24 de puțuri preacoperite cu 100 ng/mL r4-1BB Fc sau IgG1 umană timp de 24 h.

2.4. Izolarea celulelor vasculare stromale din țesutul adipos

Pentru a izola fracțiunea vasculară stromală (SVF) din țesutul adipos, tampoanele adipoase epididimale ale șoarecilor C57BL/6 (masculi, în vârstă de 8 săptămâni) au fost tocate și digerate timp de 30 de minute la 37°C cu colagenază de tip 2 (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) în DMEM (pH 7,4). Suspensiile rezultate au fost centrifugate la 500 g timp de 5 minute. Peletele au fost resuspendate în tampon de liză eritrocitară, iar suspensiile au fost incubate la temperatura camerei timp de 3 minute, apoi centrifugate la 500 g timp de 5 minute. După spălarea în DMEM, suspensiile au fost trecute prin ochiuri de nailon sterile de 100 μm (SPL Lifescience, Pocheon, Coreea). Celulele filtrate au fost transferate în vase de 100 mm2 care conțineau DMEM suplimentat cu 10% FBS și 0,4% Fungizone și au fost menținute într-un incubator la 37°C cu 5% CO2. Celulele au fost lăsate să se fixeze, iar celulele plutitoare au fost îndepărtate prin aspirare, iar mediul de cultură a fost completat în fiecare zi. Celulele SVF au fost colectate după 2 zile. Celulele SVF au fost plasate la 5 × 105 celule/poț în plăci cu 24 de puțuri. Preadipocitele confluente derivate din SVF au fost diferențiate în adipocite prin tratament cu DMEM care conține 10 μg/mL insulină (Sigma-Aldrich), 0,25 μM DEX (Sigma-Aldrich), 0,5 mM IBMX (Sigma-Aldrich) și 10% FBS timp de 2 zile. Adipocitele mature au fost menținute în mediul de cultură care a fost înlocuit cu mediu proaspăt la fiecare 2 zile. Pentru a detecta expresia 4-1BB și 4-1BBL pe adipocitele derivate din SVF expuse la factori de obezitate, aceste celule au fost incubate cu acid palmitic 250 μM, LPS 100 ng/mL timp de 24 h.

2.5. Izolarea macrofagelor peritoneale

Șoarecii C57BL/6 (masculi, în vârstă de 8 săptămâni) au fost injectați intraperitoneal cu 3 ml de bulion de tioglicolat 3% (Difco, Detroit, MI, SUA) cu 4 zile înainte de a fi uciși. Macrofagele peritoneale au fost colectate prin centrifugare în mediu MEM (Minimum Essential Medium, Gibco), iar peleta rezultată a fost spălată și resuspendată în mediu de cultură MEM cu 10% FBS. Macrofagele peritoneale au fost purificate prin aderență pe plăci de cultură tisulară timp de 2 ore . Pentru a detecta expresia 4-1BB și 4-1BBL pe macrofagele peritoneale expuse la factorii de obezitate, aceste celule au fost incubate cu acid palmitic 250 μM, LPS 100 ng/mL timp de 4 h.

2.6. Cocultura de adipocite și macrofage

Adipocitele 3T3-L1 au fost cultivate și diferențiate timp de 6 zile. Cocultura adipocitelor și macrofagelor a fost realizată prin două metode: cocultura prin contact direct și cocultura transwell. În sistemul de contact direct, macrofagele Raw264.7 (3 × 105 celule: 50 % macrofage, 3 × 104 celule: 10 % macrofage) sau macrofagele peritoneale (3 × 105 celule) au fost plasate în plăci cu 24 de godeuri care conțineau adipocite 3T3-L1 (3 × 105 celule). Celulele au fost cultivate timp de 24 h în contact unele cu altele și au fost recoltate. Ca martor, adipocitele și macrofagele au fost, de asemenea, cultivate separat, cu un număr de celule pe gode egal cu cel din sistemul de contact și au fost amestecate după recoltare. În sistemul trans-well, celulele au fost cultivate în cocultură folosind inserții trans-well cu o membrană poroasă de 0,4 μm (Corning, NY, SUA) pentru a separa adipocitele (3 × 105 celule, puțul inferior) de macrofage (3 × 105 celule, puțul superior). După incubare timp de 4 h, 8 h și 12 h, au fost recoltate supernatantele.

2.7. Măsurarea nivelurilor de citokine

Nivelurile de citokine din supernatantele de cultură au fost măsurate cu ajutorul testelor imunoenzimatice (ELISA). Testele au fost efectuate folosind OptEIA TNFα de șoarece, un set MCP-1 de șoarece (BD Bioscience Pharmingen, CA, SUA) și un set IL-6 și adiponectină de șoarece (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA), precum și un kit IL-10 (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA). Valorile pentru nivelurile de citokine au fost derivate din curbele standard utilizând programul de ajustare a curbelor SOFTmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SUA).

2.8. PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR)

ARN total extras din celulele cultivate a fost transcris invers pentru a genera ADNc folosind transcriptaza inversă M-MLV (Promega, Madison, WI, SUA). Amplificarea PCR în timp real a cADNc a fost realizată în dublu exemplar cu un kit SYBR premix Ex Taq (TaKaRa Bio Inc., Foster, CA, SUA) folosind un Thermal Cycler Dice (TaKaRa Bio Inc., Japonia). Toate reacțiile au fost realizate prin aceeași procedură: denaturare inițială la 95°C timp de 10 s, urmată de 45 de cicluri de 95°C timp de 5 s și 60°C timp de 30 s. Toate valorile pentru genele de interes au fost normalizate la valorile pentru genele de menținere (36B4 pentru adipocite; β-actina pentru macrofage și coculturi). Secvențele de primer pentru șoareci utilizate sunt prezentate în tabelul 1.

Datele au fost analizate utilizând Thermal Cycler Dice Real Time System Software (Takara Bio, Inc.). Curbele standard relative au fost generate prin reprezentarea grafică a valorilor pragului de ciclu (Ct). Pe baza valorilor Ct obținute din fiecare probă, s-au calculat cantitățile relative de gene țintă folosind curbele standard cu ajutorul software-ului furnizat de Takara Thermal Cycler Dice Real Time System.

2.9. Separarea adipocitelor și a macrofagelor

Adipocitele 3T3-L1 cultivate și macrofagele Raw264.7 în număr egal (așa cum s-a descris anterior) au fost separate în conformitate cu protocolul producătorului, utilizând sistemul CD11b MicroBeads (MACS; Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA, SUA). Pe scurt, celulele în cocultură au fost colectate, spălate de două ori cu tampon (PBS suplimentat cu 2 mM EDTA și 0,5% albumină serică bovină-BSA) și incubate cu microbile CD11b timp de 15 minute la 4°C. Celulele spălate și resuspendate au fost aplicate pe coloana MACS, care a reținut celulele CD11b+ și a permis celulelor negative (adipocite) să treacă prin ea. Coloana a fost apoi îndepărtată din separator și plasată pe un tub de colectare adecvat. Cantități adecvate de tampon de coloană au fost pipetate pe coloană pentru a spăla celulele pozitive (macrofage) cu ajutorul unui piston furnizat cu coloana. Această metodă a dus la obținerea a 90% până la 95% de celule CD11b+ pure, așa cum a fost evaluat prin citometrie în flux.

2.10. Analiza prin citometrie în flux (FACS)

Adipocite 3T3-L1 și Raw264.7 macrofage tratate cu factori legați de obezitate (așa cum s-a descris anterior) au fost ușor tripsinizate, spălate de două ori în PBS și incubate cu anticorpi de blocare a receptorilor Fcγ (24G2) timp de 10 minute la gheață, apoi colorate cu anti-4-1BB conjugat cu ficoeritrină (PE) (eBioscience, San Diego, CA, SUA), anti-4-1BBL (eBioscience), sau anti-Rat (eBioscience), Golden Syrian Hamster IgG (eBioscience) și anti-CD11b (eBioscience) ca martor pentru a defini poarta pentru adipocite/macrofage. Celulele au fost apoi spălate cu tampon FACS și analizate pe un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) cu software-ul CellQuest (BD Biosciences). Numărul din grafice indică procentele de celule pozitive.

2.11. Analiza Western Blot

Adipocitele 3T3-L1 au fost plasate la 1 × 106 celule/cavitate în plăci cu 6 godeuri și incubate cu 3E1 (1 μg/mL) sau IgG de șobolan timp de 3 h. Macrofagele Raw264.7 au fost plasate la 1 × 106 celule/cavitate în plăci cu 6 godeuri acoperite cu r4-1BB Fc sau IgG uman timp de 1 h. Adipocitele tratate cu 3E1 și macrofagele tratate cu r4-1BB Fc au fost clătite cu PBS, resuspendate prin răzuire în tampon de liză (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM MgCl2, 0,5% deoxicolat, 1% IGEPAL și cocktail de inhibitori de protează) și centrifugate la 3000 rpm timp de 5 minute. Probele care conțineau 10-30 μg de proteină totală au fost supuse analizei western blot folosind anticorpi policlonali pentru IKK fosforilat (I kappa B kinaza alfa/beta; p-IKK α/β, Ser180/Ser181), IKKβ total, p-p38 MAPK (proteina kinaza activată de mitogen), p-JNK (c-Jun amino-terminal kinaza), JNK total, p-Akt (proteina kinaza B; Ser473), Akt total (Cell Signaling, Danvers, MA, SUA), și IκBα (inhibitor al factorului nuclear-κB alfa; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SUA), și β-actina (Sigma).

2.12. Analiză statistică

Rezultatele sunt prezentate ca medii ± SEM a trei analize independente efectuate în dublu exemplar. Comparațiile statistice au fost efectuate cu ajutorul testului Student sau ANOVA cu testul Duncan cu intervale multiple. Diferențele au fost considerate ca fiind semnificative la .

3. Rezultate

3.1. Expresia 4-1BB și 4-1BBL în adipocite/macrofage și în țesutul adipos

Am măsurat mai întâi expresia 4-1BB în timpul adipogenezei la nivel de ARNm folosind qRT-PCR. Am constatat că nivelurile de transcripți 4-1BB au fost mai mari în adipocitele derivate din SVF după diferențiere (Figura 1(a)). Este important faptul că substanțele legate de obezitate, cum ar fi acidul palmitic și LPS, au crescut semnificativ nivelurile de transcripți 4-1BB în adipocitele derivate din SVF și transcripții 4-1BBL în macrofagele peritoneale (Figura 1(b)). Upreglementarea transcriptelor este confirmată în adipocitele 3T3-L1 și/sau în macrofagele Raw264.7 [Figura 1(c)]. Analiza FACS a arătat, de asemenea, că proteina 4-1BB pe adipocitele 3T3-L1 și proteina 4-1BBL pe macrofagele Raw264.7 (Figura 1(d)) au fost crescute de acești factori legați de obezitate. În plus, transcrierile 4-1BB și 4-1BBL au crescut în adipocitele/macrofagele cocultivate [Figura 1(e)], precum și în țesutul adipos epididimar al șoarecilor obezi hrăniți cu HFD [Figura 1(f)].

3.2. Eliberarea citokinelor inflamatorii și activarea moleculelor de semnalizare inflamatorie prin stimularea 4-1BB și 4-1BBL în adipocite și macrofage, respectiv

Pentru a examina dacă 4-1BB pe adipocite sau 4-1BBL pe macrofage furnizează un semnal inflamator, am tratat fiecare tip de celule cu agoniști care stimulează în mod specific aceste molecule; Adipocitele 3T3-L1 au fost tratate cu un anticorp agonist 4-1BB (3E1) timp de 48 h, iar Raw264.7 macrofage cu r4-1BB-Fc timp de 24 h și am măsurat apoi nivelurile de citokine inflamatorii în celulele respective. Atât stimularea cu 4-1BB a adipocitelor, cât și stimularea cu 4-1BBL a macrofagelor au crescut în mod semnificativ producția de citokine proinflamatorii, cum ar fi MCP-1, TNF-α și IL-6 la nivel de ARNm [figurile 2(a) și 2(c)] și la nivel de proteine [figurile 2(b) și 2(d)]. Secreția de adiponectină din adipocite nu a fost modificată de stimularea cu 4-1BB (datele nu sunt prezentate). Stimularea 4-1BBL a macrofagelor a scăzut transcriptele IL-10 [Figura 2(c)], dar nu s-a observat nicio modificare în eliberarea de proteine IL-10 [Figura 2(d)].

Figura 2

4-.Stimularea 1BB sau 4-1BBL sporește eliberarea diferitelor citokine inflamatorii de către adipocite sau macrofage. Adipocitele 3T3-L1 și macrofagele Raw264.7 au fost tratate cu 1 μg/mL 3E1 și, respectiv, 100 ng/mL r4-1BB Fc, timp de 48-24 h. Transcriptele și proteinele MCP-1, TNF-α, IL-6 și IL-10 au fost apoi măsurate în adipocitele 3T3-L1 (a-b) și macrofagele Raw264.7 (c-d). Fosforilarea IKKα/β (p-IKKα/β)/IKKβ, IκBα, p-p38, p-JNK/JNK, pAkt/Akt și β-actina au fost măsurate prin Western blotting. Adipocitele 3T3-L1 au fost incubate cu 1μg/mL 3E1 timp de 3 h (e), iar macrofagele Raw264.7 cu 100 ng/mL r4-1BB Fc timp de 1 h (f). Rezultatele densitometriei au fost prezentate ca procent din control. Datele reprezintă media ± SEM a trei experimente independente efectuate în dublu exemplar. ; ; ; ; (comparativ cu controlul).

Pentru a înțelege mecanismele moleculare prin care 4-1BB și/sau 4-1BBL activează semnalizarea inflamatorie în adipocite și/sau macrofage, am examinat efectele stimulării 4-1BB/4-1BBL asupra moleculelor de semnalizare intracelulară. Stimularea 4-1BB pe adipocite a crescut fosforilarea p38 MAPK și JNK, precum și fosforilarea IKK, molecula din amonte a NF-κB, și a indus degradarea IκBα (Figura 2(e)), în timp ce stimularea cu 4-1BBL a crescut fosforilarea Akt și p38 MAPK, precum și JNK (Figura 2(f)), dar nu a avut niciun efect asupra degradării proteinei IκBα (Figura 2(f)) și a fosforilării IKK (datele nu sunt prezentate). În concordanță cu rapoartele anterioare , semnalizarea 4-1BBL nu numai că a activat p38 MAPK, dar a indus și activarea Akt în macrofage, ceea ce a dus la creșterea expresiei citokinelor inflamatorii.

3.3. Eliberarea de citokine inflamatorii într-un sistem de cocultură de contact

Pentru că stimularea 4-1BB/4-1BBL a sporit eliberarea de citokine inflamatorii din adipocite și/sau macrofage, respectiv, am investigat dacă interacțiunea celulă-celulă prin intermediul moleculelor de suprafață, probabil 4-1BB/4-1BBL, are un rol în inițierea și declanșarea răspunsurilor inflamatorii. Am cocultivat mai întâi adipocite 3T3-L1 și macrofage Raw264.7 într-un sistem de contact direct și am constatat că producția de citokine inflamatorii IL-6, MCP-1 și TNF-α a fost corelată cu numărul de macrofage din cultură (figurile 3(a)-3(c)) și a crescut cu timpul (figurile 3(d)-3(f)).

3.4. Efectul întreruperii interacțiunii dintre 4-1BB și 4-1BBL asupra eliberării de citokine inflamatorii într-un sistem de cocultură de contact

Pentru a testa dacă interacțiunea mediată de 4-1BB/4-1BBL dintre adipocite și macrofage participă la răspunsul inflamator în cocultura de contact adipocite 3T3-L1/Macrofagele Raw264.7, am blocat interacțiunea folosind un anticorp neutralizant (TKS-1). Anticorpul monoclonal neutralizant reacționează în mod specific cu 4-1BBL de șoarece, prin care 4-1BBL nu se poate lega de receptorul 4-1BB și poate întrerupe interacțiunea dintre 4-1BBL și 4-1BB. Prin urmare, atât semnalul mediat de 4-1BB în adipocite, cât și semnalul mediat de 4-1BBL în macrofage pot fi atenuate de tratamentul cu TKS-1. Am constatat că tratamentul cu TKS-1 a redus în mod semnificativ nivelurile de ARNm IL-6, MCP-1 și TNF-α în adipocitele/macrofagele cocultivate în contact (Figura 4(a)). Reducerea expresiei acestor citokine inflamatorii a fost confirmată la nivel proteic [Figura 4(b)]. Mai mult, am constatat, de asemenea, că întreruperea interacțiunii dintre 4-1BB și 4-1BBL a redus eliberarea de citokine inflamatorii de către macrofagele peritoneale cocultivate cu adipocite [Figura 4(c)]. Pentru a examina contribuțiile relative ale semnalizării 4-1BB și 4-1BB la expresia genelor inflamatorii în adipocitele/macrofagele cocultivate, am separat macrofagele de adipocite și am măsurat nivelurile de transcripție a citokinelor inflamatorii în cele două tipuri de celule [Figura 4(d)]. Anticorpul neutralizant a redus semnificativ creșterea nivelurilor de ARNm IL-6, MCP-1 și TNF-α în adipocite, precum și în macrofage (figurile 4(e) și 4(f)).

4. Discuție

Inflamația adipoasă indusă de obezitate se caracterizează prin recrutarea macrofagelor în țesutul adipos, iar macrofagele sunt o sursă importantă de răspunsuri inflamatorii. Contactul celulă-celulă între adipocite și macrofage este considerat a fi important pentru declanșarea căilor inflamatorii în țesutul adipos , deși nu este clar ce molecule sunt implicate. Studii recente au arătat că implicarea receptorului co-stimulator 4-1BB cu ligandul său 4-1BBL prin contactul celulă-celulă modulează diverse răspunsuri inflamatorii . În lucrările anterioare, am constatat că deficiența 4-1BB a redus inflamația adipoasă prin scăderea recrutării macrofagelor și a eliberării de citokine inflamatorii . Pe baza acestor constatări, am emis ipoteza că interacțiunea celulă-celulă mediată de 4-1BB/4-1BBL între celulele adipoase și macrofage ar putea fi importantă în declanșarea și/sau menținerea inflamației adipoase induse de obezitate. În mod interesant, transcrierile 4-1BB în adipocite și transcrierile 4-1BBL în macrofage au fost semnificativ suprareglementate de factorii legați de obezitate (de exemplu, FFA și LPS), iar expresia lor a fost, de asemenea, puternic crescută în contactul adipocite/macrofage în cocultură. Mai mult, reglarea acestor molecule a fost însoțită de o eliberare sporită de citokine inflamatorii din celule. Aceste constatări, împreună cu reglarea ascendentă în țesutul adipos obez și reducerea inflamației adipoase la șoarecii obezi cu deficit de 4-1BB, sugerează că 4-1BB și 4-1BBL participă la declanșarea și/sau promovarea răspunsurilor inflamatorii induse de adipocite/macrofage.

Pentru a vedea dacă 4-1BB de pe adipocite sau 4-1BBL de pe macrofage este responsabil pentru semnalele inflamatorii care au declanșat răspunsurile inflamatorii, am stimulat celulele cu agoniști care se leagă în mod specific fie la 4-1BB, fie la 4-1BBL. Am constatat, pentru prima dată, că stimularea 4-1BB pe adipocite a crescut în mod semnificativ eliberarea de citokine inflamatorii MCP-1, TNF-α și IL-6. Stimularea semnalizării inverse mediate de 4-1BBL, despre care se știe că activează macrofagele , a crescut, de asemenea, nivelurile de citokine inflamatorii. Dovezi recente indică faptul că semnalizarea 4-1BB are ca rezultat activarea căii MAPK/NF-κB, care este dependentă de factorul asociat receptorului TNF (TRAF)-2 în limfocite . În adipocite, am constatat că stimularea 4-1BB a activat p38 MAPK, JNK, IKK și a indus degradarea proteinei IκBα. Pe de altă parte, stimularea 4-1BBL a dus la activarea moleculelor de semnalizare inflamatorie, cum ar fi Akt și p38 MAPK în macrofage, ceea ce este în concordanță cu studiile anterioare . Mai important, am constatat că tratamentul cu un anticorp neutralizant 4-1BBL a redus eliberarea de citokine inflamatorii în coculturi atât la nivelul ARNm, cât și la nivelul proteinelor. Aceste constatări împreună sugerează că interacțiunea mediată de 4-1BB/4-1BBL între adipocite și macrofage declanșează o semnalizare inflamatorie bidirecțională și este un inductor puternic de răspunsuri inflamatorii în țesutul adipos obez (Figura 5).

Figura 5

Reprezentare schematică a transducției semnalului bidirecțional indus de interacțiunea mediată de 4-1BB/4-1BBL între adipocite și macrofage. Eliberarea citokinelor inflamatorii (MCP-1, TNF-α și IL-6) ca răspuns la semnalizarea bidirecțională pare să participe la inflamația adipoasă.

În mod interesant, întreruperea interacțiunii 4-1BB/4-1BBL nu a suprimat complet eliberarea de citokine inflamatorii din adipocitele și macrofagele cocultivate. Acest lucru se poate datora prezenței altor molecule de suprafață celulară care participă la interacțiunile celulă-celulă și mediază răspunsurile inflamatorii. Într-adevăr, adipocitele și macrofagele exprimă mulți receptori și liganzi inflamatori pe suprafețele lor . De exemplu, CD40 și mediatorul de intrare a virusului herpetic (HVEM), care sunt exprimați pe adipocite, sunt considerați a fi mediatori ai semnalizării dependente de contact a macrofagelor, iar ablația acestor receptori reduce răspunsurile inflamatorii induse de obezitate . Astfel, este de conceput că și alți receptori și liganzi, pe lângă 4-1BB și 4-1BBL, sunt, de asemenea, implicați în interacțiunea dintre adipocite și macrofage care duce la inițierea și menținerea răspunsurilor inflamatorii.

În concluzie, am demonstrat pentru prima dată că interacțiunea dependentă de contact dintre adipocite și macrofage mediată de 4-1BB și 4-1BBL, care generează semnale bidirecționale, joacă un rol crucial în eliberarea de citokine inflamatorii adipoase de către aceste celule. 4-1BB și 4-1BBL, împreună cu alte molecule implicate în interacțiunea celulă-celulă între adipocite și macrofage, pot fi ținte valoroase pentru prevenirea inflamației adipoase induse de obezitate.

Conflict de interese

Autorii declară că nu au niciun conflict de interese.

Recunoștințe

Această lucrare a fost susținută de programul de cercetare Midcareer prin intermediul Fundației Naționale de Cercetare (NRF) Grant KOSEF (2009-0079485), finanțat de Ministerul Educației, Științei și Tehnologiei (MEST), și de programul Centrului de Cercetare Științifică (Center for Food & Nutritional Genomics) Grant (2012-0000643) al NRF din Coreea, finanțat de MEST.

.