Tehnici noi de izolare a microorganismelor, cu accent pe imprimarea cu laser | CDhistory

Metode noi de izolare

În prezent, o mare varietate de metode este folosită pentru a expune microorganisme noi, necultivate anterior. În special, se utilizează noi medii nutritive care conțin substanțe specifice; cultivarea se realizează în diferite condiții fizice și chimice ale mediului, cum ar fi compoziția atmosferică, temperatura și pH-ul. În plus, au fost studiate aplicațiile mediilor nutritive diluate în combinație cu perioade lungi de incubare, precum și cultivarea în comun a microorganismelor din specii diferite. În ultimii ani, au fost dezvoltate unele metode fundamental noi de cultivare bazate pe plasarea microorganismelor în mediul natural fără utilizarea mediilor nutritive. Astfel de metode utilizează camere de difuzie și acoperiri polimerice în care sunt plasate celulele microbiene. În acest caz, microorganismele primesc toți nutrienții necesari din mediul natural, rămânând izolate de acesta. Alocarea unui nou producător de antibiotic (teixobactină) folosind astfel de metode este considerată o realizare importantă. O altă abordare include cultivarea și depistarea simultană a zeci și sute de mii de microcolonii bacteriene pe cipuri de izolare polimerice sau ceramice poroase. Pentru cultivarea microorganismelor „necultivabile”, se pot utiliza, de asemenea, metode care permit izolarea de celule unice din medii naturale. Dintre aceste metode, cea mai populară se bazează pe diluția suspensiei de microorganisme, citometria în flux și sortarea celulelor, microdisecția cu laser, compartimentarea și aplicarea de micromanipulatoare. În plus față de cultivarea unor specii de microorganisme necultivate anterior, izolarea celulelor microbiene individuale este necesară pentru studiul fiziologiei celulare, al interacțiunilor dintre celule, precum și pentru căutarea de noi metaboliți, cum ar fi antibioticele și enzimele.

Progresul științific și tehnologic modern oferă multe oportunități în ceea ce privește dezvoltarea de noi metode de cultivare, izolare, manipulare și studiu al celulelor bacteriene individuale și al consorțiilor acestora. Noile abordări pot accelera semnificativ procesul de lucru cu microorganismele și pot permite realizarea unor studii mai complete și mai cuprinzătoare ale acestora. Este necesar să se remarce faptul că, până în prezent, au fost propuse foarte puține metode de poziționare a rețelelor de bacterii cu o precizie micrometrică. În Akselrod et al. au fost formate rețele tridimensionale (3D) de celule vii în hidrogel, fără pierderea viabilității acestora, folosind rețele de capcane optice holografice multiplexate (pensete) cu o precizie fără precedent (<400 nm). Pentru a forma capcane optice, au fost utilizate două lasere: laser Ar+ (20 W, lungime de undă de 514 nm) și laser Ti: Safir cu undă continuă, acordabil în intervalul λ = 850-900 nm, precum și o combinație de două elemente de difracție, combinate cu diferite lentile într-un microscop optic inversat. S-au format rețele de fibroblaste 3T3 înconjurate de un inel de bacterii. A fost demonstrată, de asemenea, capacitatea de a manipula simultan sute de bacterii Pseudomonas aeruginosa în rețele bidimensionale (2D) și 3D. Metoda de captare optică holografică este foarte precisă, dar dificil de realizat din punct de vedere tehnic.

În studiul lui Rowan et al. este propusă metoda de funcționalizare eterogenă a suprafețelor, care este un proces litografic în patru etape, bazat pe imprimarea prin microcontact a unor monostraturi organice, implantarea polimerului hiperbranșat și funcționalizarea ulterioară a acestuia. Ca urmare, se obțin structuri pe care se realizează inocularea dirijată a celulelor bacteriene. Investigațiile privind supraviețuirea celulelor au arătat că acestea rămân viabile pe suprafețele structurate obținute. S-au obținut izolate mari de bacterii care conțin 18 ± 5 bacterii și izolate mici care conțin 2 ± 1 bacterii. Conform acestei lucrări, metoda demonstrată poate fi utilizată pentru screening de mare capacitate și biosensibilizare. Cu toate acestea, este dificil de combinat funcționalizarea eterogenă a suprafețelor prin această metodă cu cercetarea biologică de rutină și condițiile de cultivare a microorganismelor (temperatură, pH, nutrienți etc.). Este necesar să se remarce faptul că sarcina de a găsi modalități simple de a oferi o rezoluție înaltă a rețelelor de bacterii vii cu oportunitatea diferitelor studii biologice a fost rezolvată în unele publicații. Abordările propuse în aceste lucrări sunt, de fapt, premergătoarele imprimării 3D.

Într-un studiu al lui Weibel și colab. a fost propusă tehnica de ștampilare a bacteriilor vii pe plăci de agaroză. S-au imprimat rețele de bacterii (dimensiunea unui singur punct cu bacterii >200 µm) pe o suprafață de până la 50 cm2. Ștampilele din polidimetilsiloxan (PDMS) au fost produse cu ajutorul tehnicii fotolitografice. Dimensiunea minimă obținută a proeminenței amprentei a fost de 190 µm la o înălțime de 140 µm, care, cu toate acestea, este departe de dimensiunea necesară pentru a separa bacteriile. Această metodă este rapidă, reproductibilă și convenabilă și poate fi utilizată pentru a controla modelul, spațierea și orientarea între colonii de bacterii diferite. În studiul lui Xu et al., rețele de bacterii vii cu rezoluție celulară au fost imprimate pe substrat de agaroză folosind ștampile elastomerice (PDMS) cu un raport de aspect ridicat, obținute prin metoda litografiei inverse in situ (RISL). Figura 1 prezintă avantajele metodei RISL față de fotolitografia standard cu ultraviolete. Singura limitare a tehnologiei RISL este diametrul protuberanței, care cu greu poate fi <1 µm din cauza limitei de difracție optică.

Metoda de imprimare prin microcontact a rețelelor de bacterii funcționează după cum urmează: Picătura de Escherichia coli în mediul de cultură LB se depune pe gel de agaroză (3 % în greutate în LB) și, pe substratul de agaroză, se formează un monostrat de bacterii (lichidul este absorbit de gelul de agaroză). Apoi, ștampila din PDMS intră în contact cu un monostrat de bacterii care acoperă gelul de agaroză. Ștampila este îndepărtată, iar partea de bacterii rămâne pe ea. Apoi, la contactul ștampilei cu stratul de gel de agaroză (4 wt% în LB, grosime de 200 µm), bacteriile sunt transferate pe stratul de agaroză. Astfel, în câteva secunde, se pot imprima rețele de bacterii E. coli direct pe substratul de agaroză cu o rezoluție de ordinul micronilor, până la bacterii unice, pe o suprafață mare (cm2). S-a demonstrat că, după imprimarea modelului, bacteriile continuă să crească și să se dividă, ca în condițiile unei culturi de masă, adică bacteriile își păstrează comportamentul fiziologic normal după imprimare. S-a demonstrat, de asemenea, că concentrația de agaroză este crucială pentru o bună performanță de imprimare. O concentrație prea mică duce la o distorsiune a modelului imprimat, în timp ce o concentrație prea mare nu este potrivită pentru cultivarea bacteriilor. Pentru a obține rețele de bacterii unice, a fost studiat efectul reducerii concentrației inițiale de bacterii într-o picătură de mediu de cultură LB. Pentru concentrațiile inițiale de 109 și 108 celule/ml, numărul mediu de bacterii pe punct a fost măsurat la 12,1 și, respectiv, 1,4. La concentrația scăzută de bacterii s-a obținut o distribuție foarte îngustă: 44,6 % din spoturi au avut doar o singură celulă de E. coli și 40,1 % din spoturi au avut 0 sau 2 celule. Aceste rezultate au demonstrat că imprimarea prin microcontact permite producerea de rețele regulate de bacterii unice. Mai mult, s-a demonstrat că această abordare a separării rețelelor de bacterii permite analizarea ratelor de creștere a liniilor individuale de bacterii. Această metodologie oferă o modalitate simplă pentru orice distribuție spațială 2D dorită a bacteriilor și poate fi utilizată atât pentru screening, cât și pentru studii privind variația fenotipică bacteriană, dinamica populației și evoluția ecosistemelor.

Un domeniu în plină dezvoltare – sociomicrobiologia – a identificat mecanismele cu ajutorul cărora bacteriile participă la relații de colaborare și competiție prin influențarea vecinilor din apropiere prin contact fizic și modificarea compoziției chimice a micro-mediului lor comun. Pentru a explora comportamentul agregatelor microbiene de mici dimensiuni, au fost dezvoltate diferite tehnologii de microprocesare care limitează bacteriile în dispozitive microfluidice, microrezonatoare și picături de lichid cu volum foarte mic. Capacitatea de a integra sistemele analitice cu microfluidica a făcut ca aceste platforme de izolare să fie atractive pentru screeningul de înaltă performanță pentru rezistența la antibiotice și analiza activității enzimatice. De exemplu, în Eun et al. este descrisă o analiză și o izolare de înaltă performanță a celulelor bacteriene încapsulate în microparticule de agaroză cu ajutorul sortare celulară activată prin fluorescență (FACS). S-au utilizat sisteme microfluidice de focalizare a fluxului pentru a crea microparticule monodisperse cu un diametru de ≈30 µm. Dimensiunile acestor particule le-au făcut compatibile cu citometria în flux și FACS, iar sensibilitatea acestor metode a redus timpul de incubare pentru replicarea celulelor înainte de efectuarea analizelor. Volumul mic de microparticule (≈1-50 picolitri ) a redus la minimum numărul de reactivi necesari pentru studiile bacteriene. Această platformă a făcut posibilă alocarea și izolarea eficientă a bacteriilor, precum și utilizarea combinației de metode pentru identificarea rapidă a țintelor pentru moleculele mici biologic active. Ca o demonstrație experimentală a acestei metode, celulele de E. coli au fost încapsulate în microparticule de agaroză, incubate în prezența diferitelor concentrații de rifampicină și analizate cu ajutorul FACS. Concentrația minimă inhibitorie a rifampicinei a fost determinată, iar mutanții spontani care prezentau rezistență la antibiotic au fost izolați cu ajutorul FACS și caracterizați prin secvențierea ADN. Cu ajutorul acestei abordări, timpul și cantitatea de antibiotice necesare pentru izolarea mutanților au fost reduse de 8 și, respectiv, de 150 de ori, în comparație cu metodele microbiologice tradiționale care utilizează plăci de agar nutritiv. Astfel, această metodă este importantă în domeniile biologiei chimice, chimiei produselor naturale, precum și pentru descoperirea și caracterizarea metaboliților secundari biologic activi.

Abordările menționate mai sus au fost utile pentru a limita dimensiunea, forma și atributele fizice (microhabitat); cu toate acestea, niciuna dintre ele nu a oferit posibilitatea de a determina în mod arbitrar geometria 3D a agregatelor bacteriene sau orientarea mai multor populații. În plus, procesul de încapsulare a celulelor în cavități cu volum foarte mic limitează adesea transportul de masă, ceea ce duce la condiții incompatibile cu creșterea și semnalizarea între populații izolate fizic. Un număr din ce în ce mai mare de dovezi evidențiază importanța microcoloniilor în reproducerea bacteriană; cu toate acestea, se observă lipsa unor instrumente pentru evaluarea sistematică a comportamentului celular în astfel de comunități. Noile strategii pentru crearea unui mediu cultural 3D la scară microscopică pot juca un rol crucial în identificarea modului în care bacteriile gestionează rezistența la antibiotice și alte comportamente sociale în agregate mici și dense.

În Connell et al. și Connell et al. este descrisă metoda de formare cu laser a camerelor 3D microscopice pe baza litografiei multifotonice (MPL). Metoda MPL are o capacitate de mare randament și capacitatea de a produce modele arbitrare. Aceasta oferă oportunități pentru producția industrială de microdispozitive 3D, cum ar fi componente micro-optice, schele pentru inginerie tisulară și cipuri microfluidice. În studiul lui Connell et al., albumina serică bovină (BSA), o proteină foarte solubilă care poate fi reticulată în hidrogeluri poroase, durabile și biocompatibile, a fost utilizată pentru a crea camere bacteriene 3D microscopice. Câteva bacterii separate au fost închise în camerele de BSA cu volumul de 1 pl și au fost apoi cultivate în populații clonale. Datorită difuziei moleculelor semnificative din punct de vedere biologic și a antibioticelor prin pereții BSA, precum și a schimbului de semnale sensibile la cvorum, a fost studiat comportamentul social al comunităților bacteriene în funcție de mărimea și densitatea populației, de forma recipientului și de viteza de curgere a mediului.

În corpul uman, bacteriile există de obicei în comunități 3D structurate, formate din mai multe specii bacteriene. Pentru a obține informații detaliate despre efectul geometriei asupra patogenității, în Connell et al. este descrisă o strategie de tipărire 3D pentru comunitățile bacteriene, în care populații distincte din punct de vedere fizic, dar interactive din punct de vedere chimic, de o anumită dimensiune, formă și densitate, pot fi organizate în mod esențial în orice formă (figura 2). Folosind această abordare, s-a demonstrat că stabilitatea unei singure specii de bacterii patogene la antibiotic ar putea spori rezistența celei de-a doua specii datorită relațiilor lor 3D. Cu ajutorul tehnicii litografice cu laser, s-au format containere microscopice cu un volum de până la 1 pl, cu o grosime a peretelui containerului de până la 2 µm în jurul unor bacterii selectate suspendate în gelatină, prin reticulația moleculelor de polipeptide din regiunea focală datorită absorbției neliniare a radiației laser de către moleculele fotosensibilizatoare. Rezultatul acestei absorbții multifotonice este formarea de oxigen singulet, care stimulează reacțiile de reticulare covalentă intramoleculară și intermoleculară între BSA și gelatină. Proprietățile fizice și chimice unice ale gelatinei au motivat interesul pentru utilizarea acesteia pentru o varietate de aplicații, inclusiv stocarea, imobilizarea și cultivarea 3D a bacteriilor. După îndepărtarea reactivului în exces, bacteriile sunt localizate în cavități sigilate formate de gelatina reticulată, care este un material foarte poros și susține o creștere rapidă a populațiilor de celule complet închise. Acesta este ușor permeabil pentru polipeptide, antibiotice și pentru semnalele fizice și chimice cu ajutorul cărora are loc interacțiunea dintre bacterii. Izolarea celulelor în microcontainere oferă posibilități de încorporare a diferitelor tipuri/densități de containere unele în altele, precum și de modificare dinamică a orientării populațiilor întregi de bacterii din cadrul comunității.

Autorii au demonstrat că interacțiunile localizate spațial ale bacteriei Gram-pozitive Staphylococcus aureus și ale bacteriei Gram-negative P. aeruginosa (doi agenți patogeni umani care formează adesea coinfecții persistente în interiorul rănilor, cateterelor și în plămânul pacienților cu mucoviscidoză) pot crește supraviețuirea stafilococului în tratamentul cu antibiotice β-lactamice.

Imprimarea celulară micro-3D extinde în mod fundamental posibilitățile de sondare a rezistenței la antibiotice atunci când un singur microgrup bacterian poate afecta sensibilitatea la antibiotice a populațiilor adiacente înconjurătoare sau încorporate – o chestiune de o relevanță deosebită pentru infecțiile in vivo (de ex, rănile, cavitatea bucală și fibroza chistică a plămânilor), unde țesuturile sunt adesea colonizate simultan de mai multe specii de bacterii. Adevărata putere a imprimării celulare 3D constă în capacitatea de a organiza comunitățile microbiene în gama nelimitată de geometrii. Imprimarea celulară micro-3D poate fi, de asemenea, un instrument valoros pentru investigarea mecanismelor și dinamicii răspunsurilor adaptative la condițiile de mediu.

.