3D Printed Bionic Ears | CDhistory

Proiectarea și punerea în aplicare a organelor și dispozitivelor bionice care îmbunătățesc capacitățile umane, cunoscute sub numele de cibernetică, a fost un domeniu de interes științific în creștere.1,2 Acest domeniu are potențialul de a genera părți de înlocuire personalizate pentru corpul uman sau chiar de a crea organe care conțin capacități dincolo de ceea ce biologia umană oferă în mod obișnuit. În special, dezvoltarea de abordări pentru integrarea multidimensională directă a componentelor electronice funcționale cu țesuturi și organe biologice ar putea avea un impact extraordinar în medicina regenerativă, în protetică și în interfețele om-mașină.3,4 Recent, mai multe rapoarte au descris cuplarea electronicii și a țesuturilor cu ajutorul unor dispozitive și senzori planari flexibili și/sau extensibili care se adaptează la suprafețele țesuturilor, permițând aplicații precum detectarea biochimică și sondarea activităților electrice pe suprafețele inimii5 , plămânilor6 , creierului7 , pielii8 și dinților.9 Cu toate acestea, obținerea unor componente electronice împletite tridimensional și fără sudură cu țesuturile și organele biologice este mult mai dificilă.4

Inginerie tisulară se ghidează după principiul conform căruia o varietate de tipuri de celule pot fi convingute să sintetizeze noi țesuturi dacă sunt însămânțate pe o schelă hidrogel tridimensională adecvată într-un mediu de creștere corespunzător.10-15 În urma unei culturi in vivo sau in vitro, se formează structuri tisulare care posedă morfologia schelei originale.16 Cu toate acestea, o provocare majoră în abordările tradiționale ale ingineriei tisulare este generarea de implanturi însămânțate cu celule cu structuri care să imite țesutul nativ, atât în ceea ce privește geometriile anatomice, cât și distribuțiile celulare intrațesutale.17 Tehnici precum însămânțarea celulelor în matrițe neadezive sau schele autopliabile au fost utilizate pentru a fabrica construcții tisulare tridimensionale cu geometrii 3D complexe.18,19 Cu toate acestea, tehnicile existente sunt încă incapabile să creeze cu ușurință părți de organe sau țesuturi cu eterogenitățile spațiale necesare și geometrii anatomice precise pentru a face față penuriei de organe donate pentru transplant.20-22 De exemplu, reconstrucția totală a urechii externe cu cartilaj autogen – cu scopul de a recrea o ureche care să aibă un aspect similar cu cel al pavilionului auricular controlateral – rămâne una dintre cele mai dificile probleme din domeniul chirurgiei plastice și reconstructive.23

Tehnicile de fabricație aditivă, cum ar fi imprimarea 3D, oferă o soluție potențială prin intermediul capacității de a crea rapid modele de proiectare asistată de calculator (CAD) prin decuparea acestora în straturi și construirea straturilor în sus folosind celule biologice ca cerneluri, în geometrii anatomice precise ale organelor umane.24-27 Variații ale imprimării 3D au fost utilizate ca metode de fabricare a formelor libere solide, deși utilizarea lor a fost limitată în principal la crearea de piese mecanice pasive.24,28 Imprimarea 3D pe bază de extrudare a fost utilizată pentru a proiecta schele de țesut dur, cum ar fi meniscuri de genunchi și discuri intervertebrale complete cu celule încapsulate.29-31 Această tehnică oferă capacitatea de a crea structuri multimateriale eterogene din punct de vedere spațial prin utilizarea unor instrumente de depunere care pot extruda o gamă largă de materiale.32 Mai mult, blocurile de construcție funcționale la scară nanometrică permit asamblarea versatilă de jos în sus a componentelor la scară macroscopică care posedă funcționalități reglabile. Acest lucru ar putea permite imprimarea simultană a materialelor nanoelectronice și a celulelor biologice pentru a obține țesuturi și organe cyborg integrate tridimensional, care să prezinte capacități unice.33,34

În cele ce urmează, prezentăm o abordare nouă din punct de vedere conceptual care abordează provocările menționate mai sus prin împletirea completă a componentelor electronice funcționale cu țesuturi biologice prin imprimarea 3D a materialelor nanoelectronice și a hidrogelurilor cu celule viabile însămânțate în geometrii anatomice precise ale organelor umane. Deoarece circuitele electronice se află în centrul dispozitivelor senzoriale și de procesare a informației35 , cultivarea in vitro a arhitecturii hibride imprimate permite creșterea unor „organe cyborg” care prezintă funcționalități îmbunătățite față de biologia umană. Abordarea noastră oferă capacitatea de a defini și de a crea construcții eterogene din punct de vedere spațial prin extrudarea unei game largi de materiale într-un proces strat cu strat până când geometria stereolitografică finală este completă. Acest concept de imprimare 3D a celulelor vii împreună cu componente electronice și de creștere a acestora în organe funcționale reprezintă o nouă direcție în fuziunea electronicii cu sistemele biologice. Într-adevăr, astfel de organe cyborg sunt distincte fie de țesutul proiectat, fie de electronica plană/flexibilă conformă și oferă o modalitate unică de a obține o fuziune tridimensională a electronicii cu țesutul.

Ca o dovadă de concept a acestei abordări, am evaluat capacitatea imprimării 3D de a crea un pavilion auditiv viabil care conține, de asemenea, electronice care permit capacități alternative la auzul uman. Organele umane care cuprind predominant țesut cartilaginos, cum ar fi pavilionul urechii, reprezintă candidați prototipuri adecvate pentru a investiga fezabilitatea abordării noastre. Acest lucru se datorează 1) complexității inerente a geometriei anatomice a urechii, care o face dificil de bioinginerit prin intermediul abordărilor tradiționale de inginerie tisulară, precum și 2) simplității structurii sale la nivel de țesut cartilaginos din cauza lipsei vasculaturii.23,36 În plus, asamblarea de jos în sus a matricelor nanoelectronice oferă capacitatea de a genera ierarhic componente electronice funcționale la scară macroscopică. În mod specific, demonstrăm imprimarea 3D a unei matrici de hidrogel de alginat cu semințe de condrocite însămânțate în alginat cu o antenă de bobină inductivă cu infuzie de nanoparticule de argint (AgNP) conducătoare de electricitate, care se conectează la electrozi în formă de cohleea susținuți pe silicon. Împreună, rezultatul este integrarea tridimensională a componentelor electronice funcționale în cadrul geometriei anatomice complexe și precise a urechii umane (Fig. 1).

În acest proces sunt implicați următorii pași. În primul rând, se utilizează un desen CAD al urechii bionice (Fig. 1A) pentru a prescrie geometria anatomică și eterogenitatea spațială a diferitelor materiale funcționale. După cum s-a descris mai sus, trei materiale cuprind cele trei componente funcționale (structurale, biologice și electronice) ale urechii bionice. Aceste materiale sunt introduse într-o imprimantă 3D Fab@Home bazată pe extrudare cu seringă (The NextFab Store, Albuquerque, NM) (Fig. 1B) (Fig. 1B). Construcția imprimată a urechii hibride bioelectronice este apoi cultivată in vitro pentru a permite creșterea țesutului cartilaginos pentru a forma o ureche cyborg cu capacitatea de a detecta semnale electromagnetice în domeniul frecvențelor radio (RF) prin intermediul unei bobine inductive care acționează ca o antenă de recepție (Figura 1C).

Pentru a demonstra abordarea noastră, am imprimat construcția urechii bionice după cum urmează. Pentru schelă, am însămânțat în prealabil o matrice de hidrogel de alginat cu condrocite viabile la o densitate de ~60 de milioane de celule/mL (a se vedea informațiile de susținere). Matricea de alginat este stabilă din punct de vedere tridimensional în cultură, netoxică, compatibilă cu preînsămânțarea și extrudarea și este un vehicul adecvat pentru livrarea de celule, deoarece reticulația poate fi inițiată înainte de depunere.37 Condrocitele utilizate pentru imprimare au fost izolate din cartilajul articular al unor viței în vârstă de o lună (Astarte Biologics, Redmond, WA). Un desen CAD al unui pavilion urechii umane în format stereolitografic (STL) cu o antenă cu bobină circulară integrată, conectată la electrozi în formă de cohlee, a fost utilizat pentru a defini traseele de imprimare prin decuparea modelului în straturi de contur și trasee de umplere raster. Reticularea a fost inițiată în matricea de hidrogel de alginat preînsămânțată cu condrocite viabile, care a fost apoi imprimată 3D împreună cu soluții de silicon conductoare (infuzate cu AgNP) și neconductoare (filmul 1). Împreună, această metodă a produs componentele biologice, electronice și structurale ale organului bionic într-un singur proces.

Figura 2A prezintă urechea bionică imprimată 3D imediat după imprimare. În mod notabil, se constată că aceasta reproduce fidel desenul CAD, în spațialitatea precisă pentru fiecare material, așa cum a fost dictat de design. Construcția tipărită a urechii a fost scufundată în medii de cultură a condrocitelor conținând 10% sau 20% ser fetal bovin (FBS), care a fost reîmprospătat la fiecare 1-2 zile (a se vedea informațiile justificative). Urechea hibridă a prezentat o bună integritate structurală și o bună păstrare a formei în cultură (Fig. 2B). În timp, construcția a devenit treptat mai opacă; acest lucru a fost cel mai evident după patru săptămâni de cultură și este în concordanță cu dezvoltarea unei matrice extracelulare (ECM). Morfologia grosieră a urechii bionice după 10 săptămâni de cultură in vitro este prezentată în Supporting Information.

Viabilitatea a fost testată imediat înainte și în timpul diferitelor etape ale procesului de imprimare. Viabilitatea inițială a celulelor a fost determinată după cultivare cu ajutorul unui test de excludere a celulelor cu albastru Trypan (Corning Cellgrow, Mediatech, VA) și s-a constatat că a fost de 96,4 ± 1,7 % (Fig. 2C) (a se vedea informațiile suplimentare). Urechea imprimată cu celule însămânțate în alginat a fost, de asemenea, testată cu un test de viabilitate LIVE/DEAD® (Molecular Probes, Eugene, OR) și a prezentat o viabilitate celulară de 91,3 ± 3,9 % cu o distribuție omogenă a condrocitelor. Acest rezultat sugerează că procesul de imprimare, inclusiv încapsularea și depunerea celulelor, nu are un impact apreciabil asupra viabilității condrocitelor.

În mod evident, această abordare de imprimare a unei matrici de hidrogel preînsămânțate elimină problemele majore asociate cu limitările de adâncime de însămânțare și însămânțarea neuniformă în metodele tradiționale de însămânțare a schelelor 3D premolate. Însămânțarea condrocitelor într-o matrice de alginat bioabsorbabil și modelarea acesteia prin imprimare 3D localizează celulele la o geometrie dorită, permițând producerea de noi ECM în locații definite atunci când sunt cultivate în medii nutritive. Pe măsură ce țesutul se dezvoltă, schela polimerică este reabsorbită (Fig. 2D), astfel încât noul țesut păstrează forma polimerului în care au fost însămânțate celulele. Schela biodegradabilă oferă fiecărei celule un acces mai bun la nutrienți și o eliminare mai eficientă a deșeurilor.

În continuare, evaluarea histologică a fost utilizată pentru a compara morfologia condrocitelor din neocartilajul urechii bionice cu cea a țesutului cartilaginos nativ. Colorația cu hematoxilină și eozină (H&E) a evidențiat o distribuție uniformă a condrocitelor în construcții (Fig. 2E) (a se vedea informațiile justificative). Histologia țesutului urechii cu colorarea Safranin O a indicat o acumulare relativ uniformă de proteoglicani în țesutul urechii cultivate (Fig. 2F). Aceste date biochimice sunt în concordanță cu dezvoltarea unui nou cartilaj.38 În cele din urmă, au fost utilizate măsurători fluorescente pentru a verifica viabilitatea țesutului urechii bionice tipărite 3D după 10 săptămâni de cultură de creștere in vitro, utilizând coloranți de diacetat de fluoresceină (FDA) și iodură de propidiu (PI). Figurile 2G și 2H prezintă țesutul care acoperă antena bobinei și, respectiv, țesutul intern care este în contact cu electrodul care trece perpendicular prin țesut. În ambele cazuri, cartilajul cultivat a prezentat o morfologie excelentă și o viabilitate la nivel de țesut. În mod notabil, această abordare de cultivare a țesutului în prezența materialelor electronice abiotice ar putea minimiza răspunsul imunitar al țesutului cultivat.

Apoi am caracterizat proprietățile mecanice ale cartilajului în diferite stadii de creștere, deoarece dezvoltarea ECM se corelează puternic cu proprietățile mecanice ale țesutului în curs de dezvoltare.39 În primul rând, s-au efectuat caracterizări biochimice și histologice extinse. Au fost prelevate probe din culturile care conțineau 10% și 20% FBS la 2, 4, 6, 8 și 10 săptămâni și au fost congelate pentru a măsura conținutul de ADN al neocartilajului și pentru evaluarea biochimică a ECM (a se vedea Informații de sprijin). Acumularea ECM în construcții a fost evaluată prin cuantificarea cantității a două componente importante ale ECM: 1) hidroxiprolină (HYP), ca marker al conținutului de colagen, și 2) glicozaminoglican sulfat (GAG), ca marker al proteoglicanilor. În săptămâna 10, conținutul de HYP a crescut la 1,2 ± 0,1 μg/mg și la 1,4 ± 0,2 μg/mg pentru culturile care conțineau 10% și, respectiv, 20% FBS (Fig. 3A). Valorile corespunzătoare ale conținutului de GAG pentru săptămâna 10 au fost de 10,6 ± 0,6 μg/mg și 12,2 ± 1,0 μg/mg (Fig. 3B). Această creștere a conținutului de GAG și HYP indică faptul că condrocitele sunt vii și active din punct de vedere metabolic în cultură.

În continuare, proprietățile de tracțiune au fost analizate prin testarea probelor de os de câine din condrocit-alginat imprimate 3D în diferite puncte ale culturii, în care osul de câine conținea aceleași densități de celule și condiții de cultură identice cu cele ale urechii (a se vedea Informații de susținere). Evaluarea proprietăților mecanice a indicat că modulul Young al oaselor de câine a crescut în timp de la 14,16 kPa la 111,46 kPa în săptămâna 10 (Fig. 3C). Oasele de câine cu o densitate mai mică de condrocite de 20 de milioane de celule/mL au fost, de asemenea, testate în condiții similare pentru a înțelege efectul densității inițiale de condrocite în proprietățile mecanice ale țesutului crescut. S-a constatat că acestea posedau un modul Young mai mic de 73,26 kPa la săptămâna 10. În continuare, a fost caracterizată duritatea țesutului cartilaginos crescut al auriculei tipărite 3D cu ajutorul măsurătorilor de nanoindentare. Indentările au fost efectuate în diferite locuri anatomice ale pavilionului auricular (Fig. 3D). După cum se arată în tabelul 1, s-a constatat că aceste valori ale durității au fost relativ uniforme, variind de la 38,50 kPa la 46,80 kPa, confirmând integritatea structurală a urechii imprimate.40

Pentru a demonstra funcționalitățile îmbunătățite ale urechii bionice imprimate 3D, am efectuat o serie de caracterizări electrice. În primul rând, rezistivitatea antenei bobinei a fost măsurată cu ajutorul unor măsurători cu sondă în patru puncte și s-a constatat că depinde de debitul volumetric utilizat pentru imprimarea siliconului conductor infuzat cu AgNP (a se vedea informațiile justificative). La debitul optim, s-a constatat că rezistivitatea bobinei imprimate este de 1,31 × 10-6 Ω-m, care este cu numai două ordine de mărime mai mare decât argintul pur (1,59 × 10-8 Ω-m). În continuare, am efectuat experimente de recepție a frecvențelor radio fără fir. Pentru a demonstra capacitatea urechii bionice de a recepționa semnale dincolo de frecvențele normale ale semnalelor audibile (la om, de la 20 Hz la 20 kHz), am format conexiuni externe la electrozii în formă de cohlee care provin din bobina inductivă a urechii bionice (figura 4A). Urechea a fost apoi expusă la unde sinusoidale de frecvențe cuprinse între 1 MHz și 5 GHz. Parametrul S21 (coeficientul de transmisie directă) al antenei bobinei a fost analizat cu ajutorul unui analizor de rețea și s-a constatat că transmite semnale pe acest spectru extins de frecvențe (figura 4B).

Cel mai important, ca un exemplu demonstrativ al versatilității modificării organului final prin modificarea designului CAD, am imprimat o ureche stângă complementară prin simpla reflectare a modelului original (a se vedea informațiile de sprijin). Canalele stânga și dreapta ale sunetului stereofonic au fost expuse la urechea bionică stângă și dreaptă prin intermediul unor antene de transmisie cu buclă magnetică cu miez de ferită (Fig. 4C). Semnalele recepționate de urechile bionice au fost colectate de la ieșirea de semnal a electrozilor dubli în formă de cohlee și au fost introduse într-un osciloscop digital și redate de un difuzor puternic pentru monitorizarea auditivă și vizuală. Extrase din semnalele transmise și recepționate cu durata de 1 ms, atât pentru urechea bionică dreaptă, cât și pentru cea stângă, sunt prezentate în figura 4D și se constată că prezintă o reproducere excelentă a semnalului audio. În mod semnificativ, muzica redată („Für Elise” de Beethoven) din semnalul recepționat de urechile bionice a posedat o bună calitate a sunetului (Filmul 2).

În rezumat, au fost fabricate „urechi de cyborg” de design care sunt capabile să recepționeze semnale electromagnetice pe o gamă extinsă de frecvențe de la Hz la GHz. Strategia noastră reprezintă o dovadă de principiu a împletirii versatilității tehnicilor de fabricație aditivă cu ansamblul de nanoparticule și conceptele de inginerie tisulară. Rezultatul este generarea de organe bionice de bună credință, atât din punct de vedere al formei, cât și al funcției, așa cum a fost validat prin repere de inginerie tisulară și măsurători electrice. Astfel de hibrizi sunt diferiți fie de țesuturile create prin inginerie, fie de electronica plană/flexibilă și oferă o modalitate unică de a obține o integrare perfectă a electronicii cu țesuturile pentru a genera organe cyborg „gata de utilizare”. În cele din urmă, utilizarea imprimării 3D cu alte clase de blocuri de construcție funcționale la scară nanometrică, inclusiv nanoparticule semiconductoare, magnetice, plasmonice și feroelectrice, ar putea extinde oportunitățile de inginerie a țesuturilor și organelor bionice.

.