Răspunsul ocular la o injecție intracamerală
S-a sugerat că celulele monocitice F4/80+ centrale pentru inducerea ACAID au fost celule rezidente ale irisului și ale corpului ciliar care au emigrat din iris prin canalul Schlemm1,6,10 în circulație. Deoarece antigenul este prezent în ochi timp de cel puțin 24 de ore, antigenul ar putea avea un efect de „depozit”, deși o parte din antigen se află în circulație rapid după injectarea intracamerală a antigenului.8 Deoarece injecția intracamerală de antigen induce apariția PBMC care induc ACAID, este probabil ca aceste celule monocitice, mai degrabă decât antigenul circulant singur să inducă ACAID.
O injecție intravitreană de antigen induce o infiltrație de celule monocitice în retină ca o etapă timpurie a uveitei.11,12 Mai mult, infecția oculară induce un puternic infiltrat inflamator în camera posterioară sau anterioară.12-14 În concordanță cu o astfel de inflamație, există o creștere a citokinelor inflamatorii în fluidele oculare, cum ar fi umoarea apoasă. În consecință, o injecție intracamerală de antigen sub formă de particule induce o creștere a ARNm pentru TNF-α, sugerând un răspuns inflamator timpuriu în camera anterioară.14,15 În plus, suprimarea sistemică a hipersensibilității de tip întârziat nu este indusă la șoarecii care primesc o injecție intracamerală de anticorpi împotriva TNF-α împreună cu antigenul, ceea ce sugerează că TNF-α este necesar în timpul inducerii ACAID. Mai mult, inducerea ACAID în aceste investigații a depins de calibrul acului utilizat pentru injectarea intracamerală a proteinelor solubile și de faptul că antigenul era sub formă de particule sau solubilă.15 Acești autori au sugerat că injectarea intracamerală a antigenelor particulate și/sau dimensiunea acului utilizat pentru injecțiile intracamerale induce o traumă necesară pentru a induce ACAID. Macrofagele și celulele dendriforme care exprimă markerul CD11c al celulelor dendritice sunt rezidente în iris, corpul ciliar și coroida din segmentul anterior.8,10,16,17 Antigenul injectat în camera anterioară este preluat rapid de aceste celule. În plus, macrofagele și celulele dendriforme se găsesc în apropierea canalului Schlemm17,18 despre care se crede că este locul de ieșire a celulelor F4/80+ din camera anterioară în circulație.1 Cu toate acestea, ieșirea în circulație a celulelor rezidente din iris care înghit antigenul a fost pusă sub semnul întrebării.16. Antigenul solubil iese rapid din camera anterioară prin circulație și se distribuie în mod similar cu antigenul intravenos.8 O parte din antigenul care iese din ochi ar putea fi într-o formă tolerogenă.19 Cu toate acestea, este probabil ca antigenul intracameral să fie prezentat în timus și splină de așa-numitele „celule prezentatoare de antigen tolerogen” care au ieșit din ochi cu antigen. Mai mult, TGF-β din umoarea apoasă sau produs de celulele F4/80+ din iris induce un fenotip supresiv în celulele F4/80+ periferice10,20,21 , sugerând că inducerea unui fenotip supresiv în celulele F4/80+ are loc în camera anterioară.
Similar tratamentului celulelor F4/80+ periferice cu umor apos și antigen, incubarea celulelor F4/80+ din exsudatul peritoneal cu antigen și TGF-β in vitro impune un fenotip supresiv asupra celulelor. Atunci când aceste celule sunt injectate iv în șoareci naivi, ele induc celule T reglatoare splenice specifice antigenului, similare cu cele obținute prin injectarea intracamerală a antigenului.21 ACAID este indusă de foarte puține celule F4/80+ tratate în acest mod1 , sugerând că celulele (nedetectabile) care emigrează din iris și corpul ciliar pot induce ACAID. Mai mult, celulele F4/80+ din iris recuperate de la șoarecii care au primit o injecție intracamerală de antigen induc inducerea ACAID sau conferă celulelor F4/80+ PBMC un fenotip supresiv similar cu cel al celulelor circulante recuperate de la șoarecii care au primit o injecție intracamerală de antigen.9,21 Este probabil că antigenul preluat și procesat de celulele prezentatoare de antigen din iris ar putea fi transferat la PBMC care s-au infiltrat în camera anterioară în același mod în care antigenul este transferat la celulele B care induc ACAID în splină de către celulele exsudatelor peritoneale tratate cu TGF-β, purtătoare de antigen.22 Luate împreună, aceste observații sugerează că evenimentele care au loc în interiorul camerei anterioare ar putea induce un fenotip supresiv asupra celulelor inflamatorii nerezidente care s-au infiltrat în camera anterioară.
Pe baza considerațiilor de mai sus, am investigat posibilitatea ca injectarea intracamerală a antigenului să inducă un aflux de PBMC circulante în camera anterioară din cauza traumei de injectare. Aceste celule infiltrate ar fi expuse la TGF-β imunosupresor din umoarea apoasă și la celulele dendriforme rezidente din iris/corpciliar care ar putea prezenta antigenul injectat la PBMC infiltrate. În concordanță cu această ipoteză, celulele care au fost recrutate în camera anterioară din cauza leziunii cauzate de injecție recirculă apoi și se îndreaptă spre timus și splină unde induc celule T reglatoare.
În 3 ore după injectarea intracamerală de ovalbumină (OVA) am constatat, de asemenea, o creștere a TNF-α în umoarea apoasă, așa cum au descris Ferguson și colab.15 În plus, am observat o creștere a chemokinei MCP-1 în umoarea apoasă la șase ore după injecția intracamerală (Fig. 1). O înțepătură de ac fără injectare de PBS a indus apariția TNF-α în umoarea apoasă, iar injectarea de PBS a crescut cantitatea de TNF-α doar de cinci ori mai mult decât cea obținută prin înțepătură de ac. TNF-α în umoarea apoasă scade rapid și nu mai este detectat la 12 ore după injectarea intracamerală de ovalbumină (OVA) (datele nu sunt prezentate). MCP-1 se menține în umoarea apoasă pentru o perioadă mai lungă de timp. Cu toate acestea, spre deosebire de TNF-α, nivelurile maxime de MCP-1 sunt atinse în umoarea apoasă la 12 ore și se mențin până la 16 ore după injectarea intracamerală de OVA (datele nu sunt prezentate). Această creștere a nivelurilor de TNF-α și MCP-1 în umoarea apoasă după injectarea intracamerală a antigenului sugerează inițierea unui răspuns inflamator în camera anterioară. Mai mult, TNF-α nu este crescut în umoarea apoasă și nici nu este indusă ACAID dacă acul utilizat pentru injecția intracamerală este prea mic și/sau dacă antigenul nu este inflamator.15
Injecția intracamerală de antigen crește TNF-a și MCP-1 în umoarea apoasă. La 3-6 ore după ce șoareci BALB/c femele naive în vârstă de 6-8 săptămâni au primit iv 5 × 106 – 1 × 107 PBMC marcate cu CFSE, șoarecii au fost anesteziați cu o injecție ip de ketamină/xilazină7 și au primit o injecție intracamerală de PBS, PBS + 50 μg OVA sau o injecție intracamerală doar cu un ac de 24 g. La șase ore după ce șoarecii naivi au primit o injecție intracamerală, umoarea apoasă a fost recuperată de la șoarecii eutanasiați și 10 μl au fost testați prin ELISA pentru TNF-α și MCP-1. Datele reprezintă media +/- S.E.M. pg detectați din 4-6 replici/grup în 2-3 experimente.
Pentru a determina dacă există un aflux concomitent de celule inflamatorii în camera anterioară în urma injecției intracamerale de antigen, șoarecii injectați iv cu PBMC marcate cu colorantul fluorescent CFSE au primit, de asemenea, o injecție intracamerală. Utilizând această abordare, am observat un aflux semnificativ de celule monocitice F4/80+ F4/80+ marcate cu CFSE și nelansate (gazdă), care exprimă receptorii de chemokine CCR2 și CCR5, după cum o demonstrează recuperarea acestor celule din iridiile șoarecilor la 24 de ore după ce șoarecii au primit o injecție intracamerală de antigen. Nu s-a înregistrat nicio creștere a acestor celule la martorii care au primit PBMC iv marcate cu CFSE, dar nu au primit o injecție intracamerală de antigen.23 La aproximativ 48 de ore după injecția intracamerală de antigen, numărul de celule infiltrate la nivelul irisului scade și crește în timus și splină (Fig. 2). Această creștere a numărului de celule monocitare circulante la nivelul irisului se datorează probabil unei infiltrări a monocitelor circulante ca răspuns la traumatismul injecției intracamerale +/- iritantul PBS și/sau antigen/PBS, deoarece numărul de celule monocitare infiltrate a crescut atunci când șoarecii au primit antigen intracameral: infiltrarea PBMC marcate cu CFSE indusă doar prin injecție a fost <injecție de PBS <injecție de TNP-BSA/PBS. Celulele monocitice recrutate la nivelul irisului după injectarea intracamerală de antigen exprimă atât CCR2, cât și CCR5.23 Migrarea celulelor la nivelul irisului necesită exprimarea CCR2, dar nu și a CCR5, deoarece CCR2 -/- PBMC nu se îndreaptă spre iris, dar CCR5 -/- PBMC se îndreaptă spre iris după injectarea intracamerală de antigen. Mai mult, injecția intracamerală de OVA la șoareci CCR2 -/- nu induce celule monocitice circulante care transferă suprimarea hipersensibilității de tip întârziat (DTH) la OVA atunci când este injectată iv la receptori de tip sălbatic.23
Migrația PBMC după injecția intracamerală. Șoarecii BALB/c anesteziați7 au primit o injecție intracamerală de albumină bovină trinitrofenilată la șase ore după ce șoarecii au primit iv 5 × 106 -1 × 107 PBMC marcate cu CFSE. La douăzeci și patru de ore după injecția intracamerală, șoarecii au fost eutanasiați prin inhalare de CO2, iar iridiile, splina și timii au fost îndepărtate, puse în comun și preparate suspensii de celule unice. Celulele au fost apoi marcate cu ficocianină-anti-F4/80 și analizate prin citometrie de flux. Creșterea procentuală a celulelor CFSE, F480+ a fost calculată prin:
.